基于指纹图谱结合多成分定量分析的蟾酥药材质量评价研究

周成美，胡晶红,2*，任 鑫，闫庆康，杨东杰，张永清,2

1山东中医药大学药学院；2山东省质量控制与中药全产业链建设协同创新中心，济南 250355； 3山东康源堂中药饮片股份有限公司，济宁 277600

蟾酥作为我国传统名贵中药，主要包含生物碱、蟾毒内酯类等多种化学成分[1]，发挥抗肿瘤、抗心肌缺血等药理活性，但其也有一定毒性，需要严格控制用量[2]。山东作为蟾酥药材的道地产区，在市场上价格昂贵，质量差异较大，甚至部分药材具有掺入蟾皮、腺体的现象，且对蟾酥的采集和初加工环节监管不够，缺乏对源头药材的质量评价。近年来，HPLC指纹图谱和多成分含量测定多用于中药质量研究，2020版《中国药典》规定华蟾酥毒基、脂蟾毒配基、蟾毒灵三种成分的总量的质量分数应不少于7.0%。然而，现存的研究缺乏多指标成分和多分析手段系统性评价研究，且至今为止文献报道蟾酥质量评价成分不够全面。本研究在此基础上新增8种成分，以沙蟾毒精、蟾毒灵等11种主要成分作为评价蟾酥质量的综合指标，通过指纹图谱对40批次蟾酥样品进行检测，结合相似性分析、聚类分析、主成分分析和偏最小二乘法判别分析结果对其质量进行全面评价[3-9]。

1 仪器与材料

Aglient 1260 HPLC色谱仪(美国Agilent公司)；KQ-500DE型超声仪(昆山市仪器有限公司)；万分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

甲醇、乙酸和乙腈为色谱级(美国赛默飞公司)；纯净水(杭州娃哈哈有限公司)。

伪异沙蟾毒精(批号Y18O9Y72597)、日蟾毒它灵(批号P17O9F72594)、沙蟾毒精(批号Y03D9Y76566)、蟾蜍它里定(批号P14J11S118458)、远华蟾蜍精(批号Y13A9Y67875)、华蟾酥毒基(批号W27M10Z84297)、蟾毒灵(批号P27F10F81703)、脂蟾毒配基(批号C30S8G45143)、蟾毒它灵(批号P28M10F84299)、脂蟾毒精(批号P14J11S118459)、南美蟾毒精(批号C25F10G81502)，纯度均大于98.0%，均购于上海源叶生物有限公司。

40批次蟾酥药材经山东中医药大学药学院张永清教授鉴定为中华大蟾蜍BufobufogargarizansCantor和黑框蟾蜍BufomelanostictusSchneider的干燥分泌物，药材具体信息见表1。

表1 蟾酥样品的基本信息Table 1 Sample information of Bufonis Venenum

续表1(Continued Tab.1)

2 方法与结果

2.1 色谱条件

安捷伦 InfinityLab Poroshell 120 EC-C18(150 mm×3 mm，2.7 μm)色谱柱；流动相为0.1%乙酸水(A)-乙腈(B)进行梯度洗脱(0～15 min，85%→72% A；15～35 min，72%→71% A；35～40 min，71%→65% A；40～50 min，65%→60% A)，柱温30 ℃，检测波长296 nm，流速0.5 mL/min，进样量5 μL，自动进样。

2.2 供试品溶液的制备

取40批蟾酥药材粉末(过3号筛)约0.1 g，精密称定，置于具塞离心管中，加入甲醇10 mL密封，称重后超声(40 kHz，100 W，60 ℃)提取60 min，放至室温后补足失重，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.3 对照品溶液的制备

分别精密称取伪异沙蟾毒精、沙蟾毒精、蟾蜍它里定、华蟾酥毒基、远华蟾蜍精、脂蟾毒配基、蟾毒它灵、脂蟾毒精、日蟾毒它灵、南美蟾毒精、蟾毒灵11种对照品适量，加甲醇溶解得质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液，摇匀即得。

2.4 指纹图谱方法学考察

2.4.1 精密度试验

取蟾酥供试液(S4)，按“2.1”项确立的色谱方法连续进样6次，以华蟾酥毒基为参照峰，分别记录其色谱结果。结果表明各共有峰的相对峰面积RSD为0.910%～2.230%，相对保留时间RSD为0.002%～0.143%，均小于5%。表明仪器精密度良好。

2.4.2 稳定性试验

取蟾酥供试液(S4)，按“2.1”项确立的色谱条件分别在 0、2、4、8、12、24 h不同时间点进样，分别记录结果，得到各共有峰相对峰面积RSD为0.890%～3.905%，相对保留时间RSD为0.014%～0.714%，均小于5%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 重复性试验

取蟾酥样品6份(S4)，分别按照“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，根据“2.1”项下条件进行检测，结果表明各共有峰相对峰面积RSD为1.060%～4.780%，相对保留时间RSD为0.002%～0.174%，均小于5%。表明方法的重复性良好。

2.5 指纹图谱的建立

2.5.1 样品指纹图谱及共有峰指认

取供试液(S1～S40)进样，分别测得其色谱图，将结果导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012年版)》，设置S1为参考图谱，采用平均数法以及时间宽度为0.1进行多点校正和全谱峰匹配分析，得到40批蟾酥指纹图谱共有模式及对照谱图谱(见图1)。在40批次蟾酥药材的对照指纹图谱中共标记21个共有峰，通过与混合对照品图谱比对、查阅文献资料共指认出 11个色谱峰(见图2)。

图1 40批次蟾酥样品的HPLC叠加指纹图谱Fig.1 Overlapping HPLC fingerprints of 40 batches of Bufonis Venenum samples

2.5.2 相似性分析

采用相似度评价系统(2012 版)，通过参照对照图谱对蟾酥指纹图谱进行相关系数计算，对样本的相似性和差异性进行分类，用相关系数评价相似度[10,11]。将蟾酥的指纹图谱与对照图谱对比，相似度在0.779～0.991之间(见表2)，表示不同批次蟾酥存在品质差异。

图2 蟾酥的HPLC对照指纹图谱(A)和混合对照品溶液的HPLC图(B)Fig.2 HPLC comparison fingerprint (A) and mixed reference substances (B) of Bufonis Venenum注：1-伪异沙蟾毒精；2-日蟾毒它灵；7-沙蟾毒精；8-蟾蜍它里定；14-远华蟾蜍精；16-蟾毒它灵；17-脂蟾毒精；18-南美蟾毒精；19-蟾毒灵；20-脂蟾毒配基；21-华蟾酥毒基。Note:1-Bufarenogin;2-Gamabufotalin;7-Arenobufagin;8-Bufotalidin;14-Telocinobufagin;16-Bufotalin;17-Resibufagin;18-Marinobufagin;19-Bufalin;20-Resibufogenin;21-Cinobufagin.

表2 40批次蟾酥样品的指纹图谱相似度评价Table 2 Similarity evaluation of 40 batches of Bufonis Venenum samples

2.6 化学模式识别分析

2.6.1 聚类分析(HCA)

聚类分析是为了消除药材数据中的不对称信息，以划分重要性为前提，将关系更接近的研究对象整合为一类[12]，实质是将多维空间中不同位置的样本，用多种方法测量样本之间的距离，建立分类[13,14]。本研究运用SIMCA 13.0软件，以40批药材的共有峰峰面积为变量进行聚类。聚类分析可以将不同批次蟾酥药材进行区分，结果如图3所示，一类包括S35～S40，一类包括S29～S34，其余28批药材为一类。

2.6.2 主成分分析(PCA)

利用SPSS 22.0软件以蟾酥共有峰的相对峰面积为指标，对数据标准化后进行主成分分析，以特征值大于1和贡献率大于85%为标准，提取出4个主成分，其累计方差贡献率为91.122%，表明这4个主成分包含了21个共有成分的91.122%的信息，符合主成分分析条件(见表3)。结果显示蟾酥主成分1特征值为13.012，方差贡献率为61.961%，对应的载荷量较大成分有8号、7号和5号色谱峰，表明主成分1受这几种成分影响较大，为蟾酥药材质量评价提供依据；主成分2的特征值为2.921，方差贡献率为13.912%，15、12和18号色谱峰载荷量较大，说明主成分2受这3个成分影响较大；主成分3和主成分4的特征值分别为1.662和1.540，方差贡献率为7.915%和7.334%，说明4个主成分代表了原始数据的绝大部分信息，碎石图显示排名前4的成分直线较陡峭(见图4)，有助于解释变量，能够综合蟾酥成分的大部分信息。通过分析得到40批次蟾酥样品中21种成分的得分图(见图4)和载荷图(见图5)。结合图4、5来看可以将40批药材分为3类，与聚类分析结果一致。

图3 蟾酥样品的聚类树状图Fig.3 Custer analysis of Bufonis Venenum samples

图4 主成分分析碎石图Fig.4 PCA scree plot of Bufonis Venenum

图5 主成分分析 (PCA) 得分图Fig.5 PCA score plot of Bufonis Venenum

表3 蟾酥药材主成分分析特征值及方差贡献率Table 3 Principal component eigenvalues and cumulative variance contribution rate of Bufonis Venenum

2.6.3 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)

为进一步区分不同采集时期样品，本研究采用偏最小二乘法判别分析建立数据模型。运用SIMCA 13.0软件对40批蟾酥21种共有成分含量进行模式识别，将标准化的共有峰峰面积导入系统进行PLS-DA。模型验证参数结果显示，解释率参数为R2X=0.752，模型区分参数为R2Y=0.999，模型预测参数为Q2=0.999，表明建立的模型合理并能做出较好的预测。分析得到PLS-DA分析得分图(见图6)，结果显示与主成分分析和聚类分析结果一致。为确定贡献程度最大的成分，变量投影重要性(variable importance in projection，VIP)体现成分对数据模型的整体贡献程度，值越大表明成分的贡献越大，一般认为VIP>1的化合物发挥了重要作用[15]，通过VIP图(见图7)分析筛选出12个变量，影响大小依次为峰7、8、5、11、10、6、3、12、20、21、2和16，以上成分也是区分蟾酥药材质量的重要成分。

2.7 多成分含量测定

2.7.1 系统适应性

分别取混合对照品和供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，伪异沙蟾毒精等11种成分与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，拖尾因子在0.95～1.05(见图1和2)。

图6 40批蟾酥药材偏最小二乘判别分析得分图Fig.6 PLS-DA score plot for 40 batches of Bufonis Venenum

图7 40批蟾酥PLS-DA 模型中11个色谱峰的VIP图Fig.7 VIP of 21 chromatographic peaks in PLS-DA model of Bufonis Venenum

2.7.2 线性关系考察

分别精密取适量的“2.2.2”项下的混合对照品溶液，按照倍数稀释法最终得出11种成分的线性回归方程，结果见表4。

表4 回归方程及相关系数Table 4 Linear equation and correlation coefficient

2.7.3 精密度考察

取蟾酥供试液(S4)，按“2.1”项下方法进样，连续进样6 次，计算11 种成分的峰面积的RSD。结果伪异沙蟾毒精等11种成分峰面积RSD 分别为0.30%、0.23%、0.22%、0.12%、0.31%、1.28%、0.29%、0.45%、0.24%、0.28%、0.82%，表明仪器精密度良好。

2.7.4 稳定性考察

取蟾酥供试液(S4)，按“2.1”项下方法分别在0、2、4、8、12、24h，计算11种成分的峰面积的RSD。结果伪异沙蟾毒精等11种成分峰面积RSD分别为0.58%、0.31%、0.25%、0.12%、0.41%、1.46%、3.34%、0.85%、0.48%、0.30%、0.81%，表明样品在24h内稳定。

2.7.5 重复性考察

取蟾酥样品(S4)6 份，分别按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，计算11 种成分含量 RSD。结果伪异沙蟾毒精等11种成分含量RSD 分别为2.26%、1.32%、1.33%、1.33%、1.43%、1.48%、1.96%、1.78%、1.57%、1.38%、1.10%，表明方法重复性良好。

2.7.6 加样回收率考察

取蟾酥样品(S4)6份，约0.1g，分别按精密加入适量对照品溶液，按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，计算加样回收率，结果见表5，结果表明该方法的回收率良好。

表5 蟾酥回收率试验结果(n = 6)Table 5 The results of recovery test of Bufonis Venenum (n = 6)

续表5(Continued Tab.5)

续表5(Continued Tab.5)

2.7.7 含量测定

精密称定40批次不同采收期的蟾酥药材粉末约0.1 g，按“2.2”项下样品处理方法制备供试品溶液，在“2.1”项中的条件进行检测，采用外标法计算各批次样品中 11 种化合物的含量百分数(见表6)。对比不同批次蟾酥各成分的含量百分数结果可知，11种成分中相差较大的是伪异沙蟾毒精，平均含量百分数为0.063%，且该成分的RSD值大于50%，作者推测是因为该成分峰面积较小(检测限和定量限分别为1.399和2.138 μg/mL)，S5批次中该成分浓度低于定量限浓度，不同批次之间含量误差较大。此外，山东省内蟾毒灵等3种药典规定成分总含量在7.100%～11.000%之间，均大于规定的7.0%，符合2020版《中国药典》要求。

表6 40批次蟾酥药材多成分含量测定 Table 6 Contend determination results of 40 batches of Bufonis Venenum

3 讨论与结论

山东省为蟾酥的道地产区，据调查山东省内蟾蜍养殖户总数多达127户，除东营市以外各市均有分布。因养殖规模差异，蟾酥质量参差不齐，指纹图谱与多成分定量分析相结合能准确判别出蟾酥样品之间的质量差异，可初步作为考察商品药材优劣的判断标准。本研究基于蟾酥样品中11种化学成分建立HPLC指纹图谱，主要针对蟾酥药材中的强心苷蟾蜍二烯羟酸内酯类成分，现代药理学实验研究表明这些成分具有抗肿瘤，免疫调节活性和衰减癌症衍生疼痛的功效。

此外，对色谱峰进行相似性分析，结果显示山东省内不同批次的蟾酥相似度大于0.900，表明山东省内不同批次的蟾酥特征成分相似度良好，但省外6批样品相似度与其他批次相比差距较大，尤其是湖南和江苏6批样品相似度在0.779～0.802之间。

为进一步分析不同批次蟾酥药材中共有峰的差异，对40批次蟾酥进行聚类、主成分和偏最小二乘法判别分析分析并对样本进行有效区分，40批样品可以分为3类，分类结果一致，不同批次之间蟾酥的质量存在差异，且偏最小二乘法判别分析的VIP分析得到贡献程度最大的12个成分包含沙蟾毒精、蟾蜍它里定、脂蟾毒配基、华蟾酥毒基、日蟾毒它灵和蟾毒它灵这6种成分。

通过含量测定不同批次的40批蟾酥药材，发现药典规定的蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基含量最高的是济宁微山的蟾酥，此外所有成分总含量排名最高的样品为日照莒县的蟾酥。山东省内的蟾酥样品在药典规定三种成分含量之和以及所有测量成分含量之和两方面均高于省外蟾酥样品，且湖南和江苏的蟾酥样品不符合药典规定，由此结果可以表明山东蟾酥在质量方面有一定的优势。山东省内蟾酥含量分析结果显示，济宁微山和日照莒县的蟾酥不仅在主成分分析中得分较高，药典规定的蟾毒灵、脂蟾毒配基和华蟾酥毒基含量较高的样品，且此样本所含成分总量在全部批次中也是较高的，因此作者认为这批样品蟾酥的综合质量最佳，造成这一结果可能与这两地气候条件和地理位置有关，为该地大力发展蟾蜍养殖提供理论依据。

综上，本研究不仅建立同时测定蟾酥中11种成分指纹图谱，还与蟾酥质量鉴定和品质评价有一定的相关性，综合评价蟾酥的质量，为蟾酥生产过程中质量控制提供科学依据。在对蟾蜍的养殖过程中，应充分考虑蟾蜍的生存条件，采用科学严谨的质量控制指标，建立更为合理科学的驯养基地，提高产地经济效益。