RhoA/ROCK-p38/ERK通路参与血管平滑肌表型转换与动脉粥样硬化关系的研究进展

廖意娟，马逸杰，饶泽华，易丽贞，吴雪芬，宋家薇，刘 欣，岳增辉

(湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410208)

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是一种以动脉内膜斑块为特征的血管类疾病。据统计，AS是导致我国严重心血管疾病的常见病理因素之一[1]。对于AS的发病机制，动脉内膜内皮细胞损伤是导致AS的始动环节，因此对与内皮细胞相关物质参与AS机制的研究较多。而研究发现AS与血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)表型变化亦存在密切关系[2]。在最初的AS形成过程中，促炎物质刺激触发信号转导和内皮细胞因子分泌，导致血管炎症，触发VSMCs去分化为增殖合成型，VSMCs不断增殖并合成大量细胞外基质，参与形成AS纤维帽[3]。随着病变的持续，AS斑块进展为易损斑块，破裂风险增高，甚至诱发血栓形成，导致危重心血管疾病的发生。因此，阐清AS形成的具体机制，有利于进一步指导AS的防治。Ras同源物基因组成员A/Ras相关卷曲螺旋蛋白激(Ras homolog gene family,member A/Ras homolog associated coiled-coilcontaining protein kinase,RhoA/ROCK)信号通路是一种非Ca2+依赖性平滑肌收缩调节信号通路。该通路可通过调控肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)等下游蛋白的磷酸化，调节平滑肌功能。多项研究证明RhoA/ROCK通路是参与AS的重要通路[4-5]。丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)与细胞增殖调控关系密切，其家族成员p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)参与VSMCs表型转换的作用尚具争议，研究发现其可能具有促进或抑制VSMCs增生的双重效应[6-7]。RhoA/ROCK作为p38 MAPK、ERK1/2上游调节因子，两者共同参与VSMCs表型转换的关联性研究及是否共同参与调控AS的探索具有一定意义。课题组前期研究证明了隔药饼灸可通过促胆固醇逆转运、抑制炎性物质表达等途径保护血管内皮细胞，从而改善AS、稳定易损斑块[8-9]，而涉及血管平滑肌的研究较少。因此，本文将从AS与VSMCs表型转换相关概念、RhoA/ROCK-p38 MAPK/ERK1/2通路参与VSMCs表型转换及AS的研究进展、隔药饼灸干预该通路防治AS可能性等方面进行综述。

1 动脉粥样硬化与血管平滑肌表型转换

AS早期以感受环境刺激(如生长因子/抑制剂、机械作用、细胞间相互作用及各类炎症介质等)、内皮细胞功能受损为主，内皮细胞激活，促炎性细胞聚集，血小板活化沉积，释放多种细胞因子，活化VSMCs和巨噬细胞，VSMCs由收缩表型去分化为高度增殖的合成表型，迁移至内膜层并增生产生大量基质，诱导巨噬细胞趋化和迁移，导致血管壁通透性增加，脂质沉积，巨噬细胞源性及VSMCs源性泡沫细胞形成，进而发展为斑块[10]。可见，VSMCs表型转换是参与动脉粥样硬化斑块形成的关键因素之一。

在正常状态下，动脉中层平滑肌细胞保持极低合成活性收缩状态；当血管损伤及炎症时，VSMCs可去分化为增殖合成型。VSMCs在内膜的迁移和增殖，参与斑块的进展[11]。VSMCs表型何为主导与其特定蛋白表达密切相关。其中，平滑肌α-肌动蛋白、肌动蛋白相关蛋白及调宁蛋白等是VSMCs收缩表型的标志蛋白；骨桥蛋白和弹性蛋白原等为增殖型VSMC的标志蛋白。而VSMCs表型的调控由环境信号决定，如机械力、特定分子的内吞作用和影响VSMCs特定基因表达的生长因子等[12]。其中，血小板衍生生长因子BB和转化生长因子β是血管平滑肌细胞表型转换的关键介质[13]，前者参与了血管平滑肌细胞特异性基因表达的主动抑制，而后者则促进了血管平滑肌细胞收缩表型形成[14]。研究证明，VSMCs特异性基因表达的调节依赖于多种因子的相互作用[15]，体内VSMCs的表型调节部分是通过抑制转录介导的，而参与该途径的因子活性由多种信号通路调控，包括RhoA/ROCK、ERK1/2、p38 MAPK等。

2 RhoA/ROCK-p38 MAPK/ERK1/2相关分子及功能

2.1RhoA与ROCK Rho蛋白属小G蛋白超家族的亚家族成员,由Rho、Rac、Cdc42等5个亚家族组成。Rho亚家族蛋白包括RhoA、RhoB和RhoC，其中RhoA为Rho亚家族蛋白的主要研究成员[16]。与所有Rho蛋白一样，RhoA在非活性鸟苷二磷酸(guanosine diphosphate，GDP)结合形式与活性鸟苷三磷酸(guanosine triphosphate，GTP)结合形式之间循环。其活化状态受到GDP/GTP鸟嘌呤交换因子、GTP酶激活蛋白、GDP解离抑制因子的共同调节[17]。Rho经典循环机制，即是细胞表面的G蛋白偶联受体与各种细胞因子、黏附分子、激素等结合，刺激GEFs集聚，促进Rho-GTP替代Rho-GDP，Rho蛋白激活，进一步识别下游效应器；GAP可加速RhoA内源性GTP酶活性，使开关失活；GDPI允许Rho蛋白在胞膜与胞质中移动。除此之外，还存在多种非经典调节机制进一步调控Rho蛋白循环，如微小核糖核酸(micro-ribonucleic-acid，miRNA)的转录后调控[18]，磷酸化与去磷酸化循环[19]等。其中，磷酸化调节在动脉壁中尤为重要。RhoA信号作为调节VSMCs功能相关的多种信号汇聚点，其他途径可能通过磷酸化调节RhoA[20]。

ROCK为RhoA主要下游效应器，由N末端的激酶域、C末端的PH区域及Rho结合区域(Rho binding domain，RBD)构成[21]。ROCK可参与调节多种细胞功能，如肌动蛋白细胞骨架组装,细胞收缩、增殖、分化等。RhoA介导的ROCK是VSMCs的主要调节因子，也是操纵这些细胞其他功能的关键因素。其亚型ROCK1和ROCK2具有65%的氨基酸序列同源性，但却发挥不同作用并调控不同靶蛋白。有学者发现ROCK1与ROCK2可能具有相反效应[22]，但仍需进一步研究验证。其中，ROCK2被认为是各种信号途径的整合点,尤其是调节VSMCs收缩的信号[23]。然而由于ROCK1和ROCK2在VSMCs中均有表达[24]，目前并不能明确ROCK不同亚型在VSMCs功能的具体作用。活化的RhoA以RhoA-GTP形式与ROCK的RBD结合后,ROCK空间结构改变,活性中心暴露，进一步发生多位点磷酸化而被激活,ROCK表现出激酶活性并磷酸化多种下游底物，如MLC、肌球蛋白磷酸酶、LIM激酶、埃兹蛋白、肌钙蛋白、粘着斑、激酶和ERK1/2等[25]，进而调节细胞收缩、增殖、迁移等多种功能。

2.2p38 MAPK与ERK1/2 MAPK家族由ERK1/2、p38 MAPK、JNK/SAPK和ERK5四个亚群组成。MAPK与细胞增殖调控关系最为密切，是细胞外信号与细胞核间信号传递的共同途径，该途径利用三级激酶级联反应(MAPKKK-MAPKK-MAPK)进行信号转导。MAPK通路可被多种胞内外刺激(包括生长因子、细胞因子和转录因子等)激活[26]，因而能介导多种细胞内生物效应。已有学者提出，MAPK信号通路可能参与血管平滑肌表型转换，但其具体机制仍需要进一步研究来阐明[27]。

p38 MAPK在分化的平滑肌中表达，并被激活ERK1/2的相同神经递质激活[28]。p38 MAPK与ERK1/2的上调可促进VSMCs增殖，而p38 MAPK在某些环境下可抑制ERK1/2活性。Kintscher等[29]发现p38 MAPK参与了血管紧张素Ⅱ(Angiotensinogen Ⅱ，ATⅡ)诱导的内皮细胞精氨酸酶活性的增加，间接促进VSMCs增殖；又可负性调节AT Ⅱ诱导的人冠状动脉平滑肌细胞ERK1/2，减少VSMCs增生。该差异性结果可能与参与调节血管紧张素Ⅱ介导的VSMCs增殖的p38 MAPK亚型不同[30]有关。ERK1/2信号被认为是细胞增殖的关键调节因子[31]。miRNA参与了ERK1/2信号通路蛋白在增殖性VSMCs中的下调。吴昊等[32]总结发现miR-24、miR-31、miR-221、miR-146a、miR-208可通过促进VSMCs增殖诱导其向合成表型转换；miR-1、miR-21、miR-26a、miR-100、miR-133、miR-365则可通过抑制VSMCs增殖和迁移、上调收缩基因以及加速VSMCs分化诱导VSMCs向收缩表型转换。miRNA在循环血液中十分稳定，许多生物标志物的研究均基于循环 miRNA 的定量[33]，因此VSMCs表型相关miRNA可在一定程度上反映ERK1/2表达情况。

3 RhoA/ROCK-p38 MAPK/ERK1/2通路关联性及进展

RhoA/ROCK被证明是MAPK家族成员的上游调节因子，ERK1/2和p38 MAPK的磷酸化依赖于RhoA/ROCK途径[34]，是p38 MAPK、ERK1/2激活所必要的[35]。

磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate，S1P)是细胞膜中鞘磷脂代谢产生的一种生物活性脂类物质，促进细胞增殖、迁移，与Cer和Sph负调控因子共同调控细胞增殖与迁移，在AS发生发展中发挥重要作用。S1P诱导VSMCs增殖迁移过程中，Rho信号通路对ERK1/2和p38 MAPK存在差异性调节。Rho通过MEK1/2调节ERK1/2活化；ROCK以与其无关的方式负性调节ERK1/2，并通过MKK3/6正性调节p38 MAPK[36]。这是G蛋白耦合受体通过Rho途径调控MAPK不同成员的首次描述。后期研究发现，S1P因受体类型的不同在VSMCs中具有促进和抑制迁移的双重作用，S1PR1/3是趋化受体，诱导VSMCs迁移，S1PR2则介导抑制细胞迁移；且S1P具有在相对低水平诱导迁移、高剂量抑制的特点，其中高浓度的S1P通过S1PR2激活ROCK，抑制VSMCs迁移[37-38]。Rho信号通路对ERK1/2和p38 MAPK产生差异性调节时，S1PR何种类型占主导及参与机制等是值得进一步研究的问题。Tong等[39]和Ngok等[40]发现，ERK1/2和RhoA/ROCK以相互激活的方式支持表皮生长因子受体途径和尿激酶型纤溶酶原激活剂刺激的细胞增殖与迁移。Taglietti等[41]却认为ROCK介导RhoA信号对ERK1/2活性的负调节。这种差异性结果可能与ERK1/2可通过磷酸化RhoA不同位点发挥不同调节作用有关。而p38 MAPK亚型亦被证明可能受RhoA的差异调节，对细胞增殖迁移发挥不同作用，其调节方式取决于RhoA自身被激活的机制[42]。Chen等[43]研究发现RhoA和ERK1分别是miR-125a-3p和miR-483-5p的靶基因，miR-125a-3p和miR-483-5p可能共同调节RhoA/ROCK1/ERK1/2信号通路的活性，通过抑制该通路可促进多发性对称脂肪瘤病的成脂作用。他们认为RhoA/ROCK1/ERK1/2信号通路是开发防治多发性对称脂肪瘤病或肥胖患者药物的潜在治疗靶点。研究中分析发现上调的miR与MAPK、Wnt、TGF-β和肌动蛋白细胞骨架信号通路的调节密切相关，而这些通路已被证明密切参与血管平滑肌增殖及AS的调控，RhoA/ROCK1/ERK1/2信号通路的研究是否参与其中值得进一步探索。而在涉及RhoA、ERK1通路的研究中，miR-125a-3p和miR-483-5定量可作为反映RhoA、ERK1表达情况的指标之一。Li等[44]通过相关基因网络分析表明，Rho 信号和MAPK/ERK信号是参与前列环素(prostacyclin,PGI2)介导的血栓素-前列腺素受体(thromboxane-prostanoid,TP)依赖性VSMCs表型转化最相关的信号通路。

由上可知，RhoA/ROCK信号通路与p38 MAPK、ERK1/2通路相互联系参与VSMCs表型转换，其中以ERK1/2更为密切。

4 隔药饼灸干预可能性

隔药饼灸属于中医灸法的一种，其本质是通过刺激相应穴位发挥中药及艾灸的药性和温热等作用治疗相关疾病。而隔药饼灸被认为是防治AS的 一种安全有效的治疗方式，但对于隔药饼灸有效防治AS的分子学机制，目前研究尚未阐明。

Huang等[45]发现艾灸可能通过抑制大鼠脊髓MAPK信号通路减轻慢性炎症性内脏痛，认为艾灸影响了ERK、JNK和p38通路，其中ERK通路占主导，MAPK/ERK通路可能是艾灸抗炎镇痛中MAPK信号通路的主要通路。而近期多项实验研究发现隔药灸能下调相应组织p38MAPK、ERK的表达参与治疗克罗恩病、子宫内膜异位症、佐剂性类风湿关节炎及慢性支气管炎等多种疾病[46-49]。本课题组前期在隔药饼灸参与防治AS机制的研究中，基于久病入络，久病多瘀，病络者治其血的原理，选取丹参、山楂、泽泻、郁金、大黄等活血化瘀降浊之药物为药饼主要成分[50]。其中，丹参与山楂是治疗心血管疾病的经典药对。基于网络药理学方法，张建永等[51]发现丹参山楂有效组分配伍(SC121)是通过多靶点、多通路及多生物途径协同抗动脉粥样硬化，但其具体机制尚未阐明。杨凯麟等[52]亦发现，丹参可多靶点多通路发挥保护内皮细胞功能、抗氧化、调节血脂、抗斑块形成四大作用，其中MAPK信号通路为关键通路之一。

由此可知，隔药饼灸防治AS可能与MAPK通路密切相关，其与p38MAPK、ERK1/2的关系值得进一步探索。

5 讨 论

内皮细胞和VSMCs之间的相互作用在调节心血管稳态中起着重要作用。内皮细胞参与AS进展的机制相对明晰，而对VSMCs的研究较少。因此，探索VSMCs参与AS的分子学机制值得进一步进行。VSMCs表型转换参与了AS斑块形成。而随着AS病变的持续，大量炎性物质浸润，脂质聚集增大，纤维帽变薄，斑块趋于不稳定、易破裂，极大增加了心肌梗死、脑栓塞等重大心血管疾病诱发的风险。调节VSMCs的增殖与迁移被认为可能是预防AS的有效策略[53]。因此，阐明VSMCs表型转换参与AS的机制，有利于进一步指导AS的防治。

RhoA/ROCK通路是参与AS的关键通路之一，该通路作为p38 MAPK、ERK激活所必要的上游调节因子，两者共同参与AS的机制值得进一步探索。VSMCs增殖与迁移参与AS斑块形成，p38 MAPK、ERK1/2与VSMCs表型转换关系密切，可能通过调控VSMCs表型变化参与AS的调控。因此，笔者认为，RhoA/ROCK通路可能通过进一步调控p38 MAPK、ERK1/2刺激VSMCs表型转换参与AS，其过程可因激活物种类及含量、RhoA磷酸化位点、p38亚型等原因出现差异性调节，但需进一步验证。

结合前述，隔药饼灸防治AS可能与p38 MAPK/ERK1/2通路参与艾灸抗炎、药饼成分降脂等作用有关。因此，隔药饼灸防治AS、稳定易损斑块与RhoA/ROCK-p38MAPK/ERK1/2通路关系的研究，是本课题组接下来的主要探索方向。但目前暂无相关研究表明隔药饼灸治疗AS与VSMCs表型转换相关，未来应着力推进隔药饼灸改善AS在VSMCs方面的机制研究，明确参与表型转换的相关蛋白、因子等，以期为AS的防治提供新的方向。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。