角倍蚜瘿内干雌蜜露的排泄和糖分组成

邵淑霞,杨子祥,何 钊,陈 航,陆 沁,许 鑫,魏洪媛,陈晓鸣

(中国林业科学研究院高原林业研究所,国家林业和草原局资源昆虫培育与利用重点实验室,昆明 650224)

角倍蚜Schlechtendaliachinensis是一种重要的经济昆虫，隶属于半翅目(Hemiptera)蚜科(Aphididae)五节根蚜亚科(Fordinae)倍蚜族(Melaphidini)，可在盐肤木Rhuschinensis叶片上取食形成富含单宁的虫瘿，称为角倍(张广学和陈小琳,1999)。每年4月中旬角倍蚜干母在盐肤木复叶叶轴翅或小叶上取食，刺激叶片组织增生膨大，形成虫瘿，干母在封闭的虫瘿内继续取食，繁殖3代，其中前2代为无翅干雌，第3代为有翅干雌，瘿内蚜虫个体数量可达数千头至上万头(Shaoetal.,2013);这些蚜虫在瘿内持续取食和繁殖，至10月中上旬，虫瘿成熟破裂，有翅干雌从裂口处迁飞至侧枝匐灯藓等藓类寄主上，在藓枝上繁殖、取食和越冬。

蚜虫是刺吸式口器昆虫，利用口针刺破植物表皮，取食植物韧皮部的汁液。植物韧皮部汁液富含糖，但氮和氨基酸的含量较低，蚜虫为了获得足够的含氮营养物质，需要不停地取食植物韧皮部汁液，多余的糖分以蜜露的形式被排出体外。蚜虫蜜露是一类含有大量简单和复杂碳水化合物，以及少量氨基酸、矿物质和维生素的混合物(Mittler,1958)。

蜜露富含多种糖类物质(Auclair,1963)，具有一定的粘稠性，常覆盖于植物的叶片与植株表面，影响植物的正常生理作用，并诱发烟煤病，影响蚜虫的生境。对于自由生活的蚜虫，其蜜露通常被蚂蚁(Way,1963;Banks and Macaulay,1967;Tilles and Wood,1982;Bristow,1984;Stechmannetal.,1996;Yaoetal.,2000;Fischeretal.,2001)以及一些寄生蜂类(Wäckersetal.,2008;Tenaetal.,2016;Benellietal.,2017;Monticellietal.,2020;Rand and Waters,2020)取食；对于生活在虫瘿内的蚜虫，有些虫瘿有孔道，蚜虫排泄的蜜露可以通过虫瘿孔道排出瘿外(Benton and Foster,1992)。但对于角倍蚜来说，封闭的虫瘿内既没有蚂蚁取食蜜露，也没有孔道供蚜虫排出蜜露，成千上万头蚜虫不停地在虫瘿内取食，虫瘿内应该会积累大量的蜜露，然而通过对角倍蚜虫瘿的连续解剖观察，发现虫瘿内干净、有序，并未发现大量堆积的蜜露。角倍蚜瘿内干雌是否排泄蜜露，如果排泄的话蜜露去了哪里，目前未见相关报道。本研究从角倍蚜瘿内干雌蜜露排泄行为观察以及食物对蚜虫蜜露排泄的影响两方面入手，旨在弄清角倍蚜瘿内干雌各蚜型蜜露排泄的情况，分析影响蜜露排泄的食物因素，为角倍蚜与其第一寄主植物盐肤木的协同进化研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

角倍蚜初始种群采自中国林业科学研究院高原林业研究所实验大棚，人工挂袋接种后，干母自然上树，取其在盐肤木叶片上取食形成的虫瘿供试。

1.2 试剂与仪器

1.2.1试剂：乙腈(色谱纯)(美国TEDIA公司)；去离子水(Millipore Purification System)；果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖、半乳糖、鼠李糖、甘露醇、麦芽糖、纤维糖、松三糖、蜜三糖、三聚糖等标准品(美国Sigma公司)；葡萄糖[生物工程(上海)有限公司]；木糖(美国Acros公司)；琼脂糖培养基；淀粉。

1.2.2仪器与设备：倒置荧光显微镜(OLYMPUS 1X71)；Agilent 1100 LC高效液相色谱仪；Hypersil BDS C18反相不锈钢柱(dp 5 μm,4.66 mm×250 mm)；5 mL一次性注射器；0.4 μm针式水性过滤头；超声波清洗器；TGL-16G高速离心机。

1.3 瘿内干雌排泄蜜露的观察

从盐肤木上采集健康的角倍蚜虫瘿，划开一个小口，置于倒置荧光显微镜(OLYMPUS 1X71)的载物台上，连续观察，拍摄记录瘿内角倍蚜干雌排泄蜜露的全过程。

1.4 蜜露糖分分析

1.4.1色谱条件：色谱柱为Hypersil BDS C18反相不锈钢柱(dp 5 μm,4.66 mm×250 mm)；流动相为乙腈-水(75∶25,v/v)；柱温35℃；检测温度：35℃；流速1 mL/min，进样10 μL。

1.4.2糖标准溶液配制：用二次蒸馏水配制糖标准品溶液，使各自的浓度均为50 mg/mL，备用。

1.4.3蜜露收集：从盐肤木上采集接近成熟的虫瘿，划开，取瘿内干雌，用毛笔轻轻拍打蚜虫腹部末端促其排泄蜜露，用毛细管收集蜜露，用于蜜露糖分分析。

1.4.4蜜露处理：将收集到的蚜虫蜜露，加入30 mL水，水浴超声波提取10 min，经12 000 r/min高速离心后，取上清液经0.45 μm滤膜过滤，待进样分析。

1.4.5糖分分析：将处理后的蜜露样品溶液进行液相色谱分析，进样量为10 μL，测定样品中糖分的相对含量，设3次重复。

1.5 蔗糖和淀粉浓度对角倍蚜蜜露排泄的影响测定

利用琼脂糖培养基、蔗糖、淀粉，分别配制蔗糖浓度为0,1%,2%,3%,5%和7.5%的培养基，以及淀粉浓度为0,2%,3%,5%,7.5%和10%的培养基，备用。

采集健康的虫瘿，划开，挑选健康、体型完好的无翅干雌及有翅干雌若蚜，转移到不同浓度蔗糖或淀粉培养基的培养皿内，200头/皿，置于24℃的黑暗的环境中保育4 d后，观察记录蚜虫存活数和蜜露数量，计算蚜虫的泌露率。每个处理5个重复。

泌露率=(蜜露数/蚜虫总数)×100%。

1.6 数据分析

实验数据分别采用SPSS 11.5和Excel 2016进行分析和制图，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和S-N-K(Student-Newman-Keuls Test)法进行差异显著性分析；利用标准品滞留时间对蜜露糖分进行定性分析，采用峰面积归一化法对蜜露糖分进行相对定量和比较。

2 结果

2.1 角倍蚜瘿内干雌的蜜露排泄行为

在角倍的整个生长期，通过对角倍内蜜露排泄情况的连续观察发现，当角倍内蚜型为无翅干雌时，角倍内干净、整洁，几乎未见蜜露分布，也很少能观察到无翅干雌排泄蜜露的情况(图1)；当角倍内蚜型以有翅干雌为主时，角倍内可见被蜡粉包裹的蜜露，35.40%±2.41%的有翅干雌可被观测到排泄蜜露(图1和2)。

图1 角倍蚜瘿内干雌排泄蜜露的比较Fig.1 Comparison of honeydew excretion of Schlechtendalia chinensis fundatrigeniae living in gallnutsG1,G2:瘿内无翅干雌Apterous fundatrigeniae in gallnuts;G3:瘿内有翅干雌Alate fundatrigeniae in gallnuts.

图2 角倍蚜有翅干雌在角倍内排泄蜜露Fig.2 Honeydews excreted by alate fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis in gallnuts红色箭头指示有翅干雌排泄的蜜露。Red arrows indicate the honeydew excreted by alate fundatrigeniae.

角倍蚜排泄蜜露时，首先在肛门处形成球状液珠，当球状液珠即将排出肛门时，蚜虫身体则向上倾斜，头和胸部几乎不动，腹部则上下来回运动，同时，两只后足也会有节奏地做上下垂直运动，当后足位于腹部末端时，角倍蚜便会利用其后足胫节端部将球状液珠踢掉。由于角倍内含有大量的蜡粉，因此，蚜虫排泄的蜜露常被有一层蜡粉，蚜虫有时可在有蜡粉包被的蜜露表面行走。角倍蚜排泄的蜜露，可在瘿内聚集成团，形成直径可达0.3～0.6 cm的大液珠，但数量较少。此外，少部分蜜露在瘿内还可变为褐色的液珠。

2.2 角倍蚜瘿内干雌蜜露糖分

角倍内蜜露样品层析谱被分成了7个点，其保留时间分别为8.53,9.73,11.78,13.23,13.86,15.34和16.07 min，与标准糖层析谱比较，确定该蜜露含有7种糖，分别为果糖、葡萄糖、蔗糖和4种未知组分(图3和表1)。蜜露所含的7种糖分中，果糖和葡萄糖的含量占绝对优势，分别为51.07%和31.68%;蔗糖的含量较低，仅为1.59%;4种未知组分的总含量为15.66%(表1)。

图3 角倍蚜瘿内干雌蜜露糖分HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of sugars in the honeydew excreted by Schlechtendalia chinensis fundatrigeniae living in gallnuts1:果糖Fructose;2:葡萄糖Glucose;4:蔗糖Sucrose;3,5,6,7:未知组分Unknown components.

2.3 蔗糖和淀粉浓度对角倍蚜瘿内干雌蜜露排泄的影响

2.3.1对无翅干雌蜜露排泄的影响：将无翅干雌置于不含蔗糖的琼脂糖培养基上，可以明显看到蚜虫排泄蜜露(图4)，泌露率为23.89%±5.58%，显著高于其他5种蔗糖浓度的培养基上的(P<0.05)；当在琼脂糖培养基中添加蔗糖时，蚜虫蜜露排泄量显著降低(P<0.05)，且随蔗糖浓度的增加，蜜露排泄量减少，当蔗糖浓度增至5%时，蜜露排泄量稍有增加，泌露率为1.66%±1.32%，而后随蔗糖浓度的增加，泌露率又降低，当蔗糖浓度增至7.5%时，泌露率仅为1.36%±0.69%(图5:A)。

表1 角倍蚜瘿内干雌蜜露糖分的相对含量Table 1 Relative contents of sugars in the honeydew excreted by Schlechtendalia chinensis fundatrigeniae living in gallnuts

图4 角倍蚜无翅干雌在琼脂糖培养基上排泄蜜露Fig.4 Honeydews excreted by apterous fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis on agarose media红色箭头指示无翅干雌在琼脂糖培养基上排泄的蜜露。Red arrows indicate the honeydew excreted by apterous fundatrigeniae on agarose media.

由图5(B)可见，淀粉对无翅干雌蜜露排泄的影响与蔗糖类似，随着淀粉浓度的提高，蜜露排泄量逐渐降低，但降低幅度不如添加蔗糖时明显。在培养基中添加2%的淀粉时，无翅干雌的蜜露排泄量稍有降低，但仍高达17.31%±9.60%；当淀粉浓度高达10%时，无翅干雌泌露率仅为5.60%±2.20%。

2.3.2对有翅干雌蜜露排泄的影响：把有翅干雌饲喂在淀粉和蔗糖含量为零的琼脂糖培养基上时，有翅干雌蜜露排泄量很高，泌露率高达173.96%±28.61%；当在琼脂糖培养基中添加1%的蔗糖时，有翅干雌蜜露排泄量显著降低(P<0.05)，泌露率降至21.15 %±10.32%；而后随着蔗糖浓度的升高，有翅干雌蜜露排泄量均有不同程度的降低，但各浓度间的差异并不显著(P>0.05)；当蔗糖浓度达到5%时，有翅干雌泌露率稍有增加，泌露率为7.31%±7.81%；当蔗糖浓度升至7.5%时，有翅干雌几乎不排泄蜜露，泌露率仅为0.79%±0.60%(图6:A)。

由图6(B)可见，当在培养基中添加2%的淀粉时，有翅干雌蜜露排泄量显著升高(P<0.05)，泌露率由173.96%±28.61%升高至236.81%±55.67%，而后随着淀粉浓度的升高，有翅干雌蜜露排泄量逐渐降低，但降低幅度不大，各浓度间的差异并不显著(P>0.05)；当淀粉浓度高达7.5%时，有翅干雌的蜜露排泄量显著减少(P<0.05)，当淀粉浓度达到10%时，泌露率降为55.92%±7.22%。

图5 蔗糖(A)和淀粉(B)浓度对角倍蚜无翅干雌蜜露排泄的影响Fig.5 Effects of sucrose (A) and starch (B) concentrations on the honeydew excretion of apterous fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis图中数据为平均值±标准差；柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05,单因素方差分析和S-N-K法)；图6同。Data in the figure are mean±SD.Different letters above bars indicate significant difference at the 0.05 level by one-way ANOVA and S-N-K.The same for Fig.6.

图6 蔗糖(A)和淀粉(B)浓度对角倍蚜有翅干雌蜜露排泄的影响Fig.6 Effects of sucrose (A) and starch (B) concentrations on the honeydew excretion of alate fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis

2.4 蔗糖和淀粉浓度对角倍蚜瘿内干雌死亡率的影响

在培养基中添加不同浓度蔗糖或淀粉饲喂瘿内干雌时，并不会造成干雌的大量死亡。其中，无翅干雌在未添加蔗糖和淀粉的培养基上的死亡率均为3.64%±1.34%，当添加不同浓度的蔗糖时，死亡率最高为5.06%±0.42%(蔗糖浓度为1%时)，最低为2.70%±0.67%(蔗糖浓度为2%时)，且各蔗糖浓度间无翅干雌死亡率的差异并不显著(P>0.05)(表2)；当在培养基中添加不同浓度的淀粉时，无翅干雌死亡率的变化幅度较小[(2.99%±0.69%)～(3.98%±1.06%)]，各浓度间差异亦不显著(P>0.05)(表2)。

有翅干雌在不同蔗糖浓度的琼脂糖培养基上生存均较好，几乎无死亡，仅是在蔗糖浓度为2%的琼脂糖培养基上稍有死亡，但死亡率很低，仅为0.45%±0.52%(表2)。淀粉浓度对有翅干雌死亡率的影响也很低，仅在淀粉含量为3%和10%时，有翅干雌稍有死亡，死亡率分别为0.17%±0.03%和0.23%±0.05%，其余处理有翅干雌均无死亡(表2)。

表2 蔗糖和淀粉浓度对角倍蚜瘿内干雌死亡率(%)的影响Table 2 Effects of sucrose and starch concentrations on the mortality (%) of fundatrigeniae of Schlechtendalia chinensis living in gallnuts

3 讨论

虫瘿是致瘿昆虫与寄主植物在长期协同进化过程中形成的产物，其形成机制、结构和功能一直是昆虫学和进化生物学研究的热点。虫瘿内排泄物和废弃物的清洁对于维持种群的生存至关重要。半封闭的虫瘿通常在虫瘿上形成孔道，瘿内昆虫可以将蜜露等废弃物通过孔道排出瘿外。例如，一种坚角蚜Ceratoglyphinastyracicola，可以在栓叶安息香叶片形成上部有孔的半封闭虫瘿，另有一种绵蚜Hormaphiscornu可以在金缕梅叶片上形成下部有孔的虫瘿(Korgaonkaretal.,2021)；瘿内蚜虫的排泄物和废弃物可以通过孔道排除瘿外(Kurosu and Aoki,1991)。角倍蚜虫瘿是完全封闭型虫瘿，瘿内成千上万的蚜虫，其排泄物蜜露、废弃物蜕和蜡粉等是如何处理，以保持瘿内的干净和有序的呢？

自然界中，大多数蚜虫排泄的蜜露中含有高浓度的松三糖(Kiss,1981;Völkletal.,1999；Fischeretal.,2002)，这种三糖是由2个单位的葡萄糖和1个单位的果糖在蚜虫的肠道中合成的(Bacon and Dickinson 1957;Ashfordetal.,2000)。然而，本研究发现，角倍蚜瘿内干雌蜜露的主要成分为果糖和葡萄糖，含量分别为51.07%和31.68%，蔗糖的含量很低，仅为1.59%(图3)。果糖和葡萄糖为单糖，分子量小，可以直接被植物吸收和利用。陆沁等(2018)的研究结果表明，角倍蚜虫瘿内壁分布有大量的缝隙和孔，这些缝隙和孔有可能吸收了以单糖为主的瘿内干雌排泄的蜜露；Chen等(2020)的研究也表明，瘿内干雌排泄的蜜露有可能被虫瘿内壁吸收和再利用，角倍蚜虫瘿类似于“代谢和营养交换中心”(metabolic and nutrient exchange hub)，不仅可以实现角倍蚜与寄主植物的营养交换，又避免了蜜露对瘿内环境造成的污染；同时，干雌分泌的蜡粉，通过干雌的活动和虫瘿的摇动，将蜜露和蜕等聚集成团，保持了瘿内的清洁(魏洪媛等,2021)。

角倍蚜瘿内无翅干雌和有翅干雌均以角倍内壁的汁液为生，然而无翅干雌几乎不易被观测到排泄蜜露(图1)，35.40%±2.41%的有翅干雌可被观测到排泄蜜露。蚜虫蜜露的组成以及泌露量受多种因素的影响，包括寄主植物、大气中CO2浓度(Sunetal.,2009;Fu etal.,2010;Boullisetal.,2018)、蚜虫种类(Völkletal.,1999)、蚜虫基因型(Vantauxetal.,2011;Katayamaetal.,2013)、虫龄(Fischeretal.,2002)以及蚜虫内共生菌(Schillewaertetal.,2017)等。其中寄主植物是最主要的影响因素，寄主植物韧皮部汁液组分的变化会对蜜露的成分以及数量产生影响(Fischeretal.,2005;Leroyetal.,2011;Pringleetal.,2014)。Schillewaert等(2017)发现，以甜菜、罂粟、蚕豆饲喂同一种蚜虫，取食蚕豆的蚜虫蜜露中总碳水化合物的浓度最高。本研究采用琼脂糖培养基来分别饲喂角倍蚜无翅干雌和有翅干雌，通过在琼脂糖培养基中添加不同浓度蔗糖或淀粉来验证食物对蚜虫蜜露排泄的影响。角倍蚜无翅干雌和有翅干雌在试验所用几种处理培养基上死亡率非常低，保证了实验的顺利进行。研究发现，在琼脂糖培养基上可以轻易地观察到无翅干雌排泄蜜露的行为，而此行为在角倍内很难观测到；此外，在琼脂糖培养基中添加不同浓度蔗糖或淀粉时，无翅干雌和有翅干雌的蜜露排泄量均受很大程度的影响。本研究结果说明角倍蚜的蜜露排泄量与其摄取食物的种类有关。

在角倍的整个生长发育过程中，瘿内蚜虫的数量由1头增加至上万头，这些蚜虫在角倍内不停的取食，势必会排泄大量的废弃物。在与寄主植物长期的协同进化历程中，瘿内角倍蚜是如何处理这些排泄物，从而防止污染其所生活的密闭生境的？这是一个值得深入研究的问题。本研究仅是从蜜露成分及食物因素两方面对蜜露去向问题进行了初步推测，为了弄清角倍蚜处理蜜露的方式，还需要进行大量生态学和生理学方面的工作。