酒精性肝病患者肠道微生态变化研究进展*

张改霞，陈海震 综述， 黄 晶 审校

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是全球范围的慢性肝病类型，可从单纯性脂肪肝发展为酒精性脂肪性肝炎(alcohol steatohepatitis，ASH)。慢性ASH会导致肝脏发生纤维化并进展为肝硬化，甚至导致肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。其中严重的ASH(伴或不伴肝硬化)可导致酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)，这是ALD的急性临床表现，与肝衰竭和高死亡率相关[1]。ALD的不同临床转归可能与遗传、免疫、饮食和肠道微生物等多种因素相关，其中肠道微生态的改变在ALD的发病机制中起着重要作用[2]。正常成人肠道中携带有至少1个门的细菌(约500～1000种细菌)，数量级与人体细胞数量接近，其中约99%为厌氧菌，包括双歧杆菌、乳酸杆菌、类杆菌、真杆菌、梭菌等；其次为需氧菌及真菌，此外还有正常的病毒群、螺旋体等[3]。长期大量饮酒会导致肠道微生物群发生数量和质量的改变,增加肠道炎症和通透性，导致全身炎症和组织损伤/器官病变(包括肝脏)。本文将对饮酒导致的肠道微生态的改变，及其对ALD的促进作用和相关生物标志物的最新研究进展作以综述。

1 ALD患者肠道微生态特点

1.1细菌数量与构成的改变 长期大量饮酒会引起肠道稳态的一系列改变，包括肠道pH、肠道动力、胆盐、免疫防御因子、细菌的代谢产物、以及细菌对肠道营养物质和结合位点的竞争，导致肠道细菌菌群和肠道屏障的改变。用聚合酶链法或常规培养技术检测发现肠道中细菌总数大量增加，但肠道细菌的多样性降低。对ALD患者结肠粘膜研究发现，细菌菌群的改变表现为变形杆菌增加，拟杆菌减少[4]。长期喂食酒精的小鼠粪便中乳酸杆菌降低，类杆菌门和厚壁菌门减少，革兰阴性变形杆菌门和革兰阳性放线菌门的比例增加，其中革兰阴性产碱杆菌和革兰阳性棒状杆菌显著增加。这种生物失调可能与乳杆菌、杆菌科、小球菌属、明串珠菌和乳球菌的显著减少有关[5,6]。长期摄入酒精也会改变回肠和肝脏的细菌多样性，其中普雷沃氏菌不仅在回肠的粘液层中增加，也在肝脏中增加[7]，证明菌群可能从肠道向肝脏发生了转移。另外，在酒精诱导的小鼠模型中发现，阿克曼氏菌的水平显著降低，且该菌的丧失驱动了放线菌的增加和疣微菌的减少，是肠道生态失调的早期标志[8]。通过对双胞胎进行酒精使用障碍量表调查(alcohol use disorders identification test，AUDIT)，发现AUDIT评分高的受试者的肠道中罗斯伯里氏菌数量降低，影响肠道屏障功能，造成肝脏损伤[9]。严重的AH患者肠道以双歧杆菌和链球菌数量较多和奇异菌较少为特征[10]，而酒精性肝硬化患者肠道普雷沃氏菌、肠杆菌、韦氏菌和链球菌等潜在危险细菌也显著增加[11-13]。

1.2 细菌及其产物的移位 在肠道内，微生物及其代谢产物通过门静脉转移到肝脏。肝脏通过向胆道和体循环释放胆汁酸和生物活性介质与肠道沟通。对小鼠酒精饮食喂养的不同阶段研究发现，饮酒早期就出现了肠道通透性增加以及细菌及其产物移位；通过细菌在肠系膜淋巴结中定量培养证明， 继续饮酒会进一步诱导肠道细菌过度生长[5]。经肠道屏障和门静脉移位的细菌或内毒素激活肝脏巨噬细胞，诱发先天性和获得性免疫反应导致肝脏损伤，与酒精对肝脏的直接作用共同促进ALD的发展[14]。因此，来源于肠道菌群的内毒素可以作为细菌移位的标志物之一。肠道菌群紊乱会诱导对肠道屏障功能具有重要保护作用的短链脂肪酸和饱和长链脂肪酸的产生减少，进一步促进细菌和微生物毒素发生移位。研究证明可通过补充短链脂肪酸和饱和长链脂肪酸减轻肝脏炎症反应[15,16]。另外，ALD中肠-肝轴循环的胆汁酸谱也发生改变，其中结合胆汁酸和总胆汁酸浓度升高，在肠道菌群紊乱和屏障损伤中发挥重要的作用[17]。

1.3 肠道真菌的变化 健康人体肠道真菌菌落主要由酵母菌、马拉色菌和念珠菌组成。对ALD患者的肠道真菌菌群研究显示，真菌多样性和丰富度降低，其中，腐质霉属、镰孢属、曲霉属相对增加，而念珠菌属相对降低，主要表现为近平滑念珠菌降低，而白色念珠菌增加[18,19]。研究发现长期饮酒会导致肠道真菌菌群及β-葡聚糖向全身循环转运，在骨髓嵌合体小鼠模型中发现β-葡聚糖可通过C型凝集素样受体CLEC7A诱导Kupffer细胞和其他可能来自骨髓的细胞发生炎症，引起IL-1β表达分泌增加导致肝细胞损伤，进一步促进酒精诱导的肝病的发展[19]。另一方面，增加的白色念珠菌可以分泌一种细胞溶解肽外毒素-念珠菌溶素，可以直接损伤上皮细胞和粘膜，也可以通过c-Fos和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路诱导炎性细胞因子的产生。在乙醇喂养的小鼠中证明念珠菌溶素不引起明显的肠道破坏，主要是通过肠上皮细胞间隙进入肝脏，以计量依赖方式损伤肝细胞[18]。

1.4 肠道病毒的改变 人类肠道病毒是每个人特有的，主要包含噬菌体。研究发现在ALD患者中肠道病毒多样性增加，与细菌多样性呈负相关，但许多噬菌体与其宿主细菌总量呈正相关[20]，与其他疾病中的变化一致[21]。AH患者的病毒变化最为显著，其中，乳球菌噬菌体和类杆菌噬菌体的数量降低，而乳杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体、肠杆菌噬菌体和肠球菌噬菌体以及细小病毒科和疱疹病毒科的数量增加。并且特定的病毒分类，如：葡萄球菌噬菌体和疱疹科病毒，与疾病严重程度及90天死亡率相关[20]。肠道病毒可以通过引起宿主免疫反应直接影响宿主，也可以作为哺乳动物病毒的来源，改变细菌微生物组成从而影响疾病。

2 肠道微生态改变在ALD发病机制中的作用

2.1 肠道屏障破坏和肠道通透性增加 完整的肠道屏障是肠肝轴相互作用的重要组成部分，由几个物理和免疫层组成[22]。上层是粘液层，由肠杯状细胞合成和分泌的粘蛋白组成，主要为粘蛋白2(mucoprotein 2，Muc2)，具有预防机械、化学和生物攻击的作用，有助于维持肠道平衡[23]。长期饮酒会导致粘液层增厚，同时会抑制抗菌凝集素再生胰岛衍生3β(regenerating islet‐derived 3 beta，Reg3b)和再生胰岛衍生3γ(regenerating islet‐derived 3 gamma，Reg3g) 的表达，导致肠道细菌过度生长、肠道微生物组成改变，促进ASH发生。实验证明Muc2缺陷型小鼠可以促进Reg3b和Reg3g的产生，可以降低ASH的发生[24]。中层为上皮细胞层，相邻细胞之间通过顶端连接蛋白(包括claudins、occludins、JAMs和E-cadherins)紧密结合。酒精及其代谢物可以通过作用于紧密连接的复合物，引起通透性增加。例如：代谢产物乙醛诱导Caco-2单层细胞旁通透性增加[25]，乙醇诱导的CYP2E1通过硝基氧化应激的方式增加肠道Caco-2细胞和大肠的通透性，在肠道渗漏和内毒素血症中起着核心作用[26]。下层为固有层，其常驻细胞群体为天然免疫细胞和获得性免疫细胞。慢性ALD动物模型证明长期饮酒会诱导固有层炎症细胞包括单核细胞和巨噬细胞产生肿瘤坏死因子α，与肠上皮细胞上的TNF受体I通过激活肌球蛋白轻链激酶而部分介导紧密连接破坏[27]。

2.2 肠道菌群移位加速ALD的进展 在肠道中，酒精诱导的生物失调和细菌移位导致病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)的积累[28]。PAMPs通过门静脉进入肝脏，激活先天性和获得性免疫反应。PAMPs，如脂多糖、肽聚糖和病毒RNA等可以与Kupffer细胞和肝星状细胞上的模式识别受体结合诱导局部炎症。主要通过肝脏免疫细胞Toll样受体-4(Toll-like receptor4，TLR4)和TLR2识别PAMPs，TLR信号进一步激活下游促炎级联反应，导致MyD88介导的NF-κB激活，促进肝脏炎症反应。另外，饮酒导致的微生物及其产物发生移位进入肝脏并与Kupffer细胞上的TLR4结合，促进miR-155的表达，增加炎症反应并加速纤维化进展。在miR-155基因敲除小鼠模型中，缺乏miR-155可以减缓慢性酒精诱导的肝脏炎症反应和纤维化[29]。同时，TLR4信号还通过下调转化生长因子-β(TGF-β)的受体激活肝星状细胞，促进肝纤维化。这些损伤过程都会诱导炎性细胞因子的表达，氧化和内质网应激，进一步增加肝损伤。此外，PAMPs除了通过门静脉入肝引起肝脏炎症，也可以通过体循环引起全身性炎症反应，增加患者不良预后和死亡风险。

3 ALD诱导肠道微生态改变的相关生物标志物

目前，激素仍然是ALD的主要治疗方案，但疗效非常有限，且易发生机会性感染。对于终末期ALD患者，肝脏移植的机会非常渺茫，短期死亡率非常高。因此，通过对ALD与肠道微生态之间的相互作用机制的不断研究，发现肠道微生态相关的ALD生物标志物，有助于早期对ALD进行评估，早期进行治疗。

3.1 缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF) HIF在缺氧、脂多糖存在等环境中参与抗炎或组织保护信号通路的转录调控。研究显示，肠道HIF-1α对于酒精引起的肠道菌群变化、肠屏障功能损伤、内毒素血症和肝脂肪变性至关重要[30]。肠上皮特异性HIF-1α敲除(IEhif-1α-/-)小鼠表现出厚壁菌/类杆菌比率显着降低，阿克曼氏菌丰度增加和乳杆菌水平显著的降低。许多屏障保护基因受HIF-1α的缺失而影响表达，导致肠上皮通透性增加。研究发现鼠李糖乳杆菌有益于预防、治疗小鼠ALD，但当肠道中缺失HIF-1α时，其作用就会减弱[31]。HIF-1α在线粒体中也发挥重要作用，以应对各种因素引起的氧化应激，可能对酒精引起的肝脏氧化应激起保护作用[32]。因此，HIF-1α可以通过多种途径保护肠道和肝脏，并作为ALD的治疗靶点。

3.2 溶细胞素 溶细胞素是由粪肠球菌产生的一种细菌外毒素。实验证明在AH患者粪便中，粪肠球菌的数量增加，溶细胞素阳性的粪肠球菌的存在与AH的严重程度和死亡率有关[33]。酗酒会降低岩藻糖基转移酶2(fucosyltransferase 2 ，Fut2)介导的肠道α-1-2-岩藻糖基化，而肠内α-1-2-岩藻糖基化的缺失会促进溶细胞素阳性粪肠球菌在肠道生长繁殖[34]。溶细胞素的作用不仅对革兰氏阳性细菌有裂解活性，而且可能通过形成孔隙对真核细胞也有裂解活性。据统计，在溶细胞素阳性的AH患者中，89%的患者在入院后180天内发生死亡，而溶细胞素阴性的患者只有3.8%死亡，表明溶细胞素是AH患者死亡的预测因子[35]。另外，研究发现粪肠球菌噬菌体可显著降低肝脏中的溶细胞素水平以及粪便中粪肠球菌的数量[33]。因此，Fut2及粪肠球菌噬菌体将是治疗ALD 的重要靶点。

3.3 其他标志物 肠道上皮细胞层中的两种抗微生物剂，Reg3b和Reg3g可以修复肠道屏障的损伤，减少细菌移位和肝脏的损伤[35]。Reg3b和Reg3g的产生受白细胞介素22(interleukin 22，IL-22)的调节。而在ALD中，IL-22产生减少是由于酒精诱导和肠道中吲哚-3-乙酸( indole-3-acetic acid，IAA)水平降低的结果。IAA是由具有色氨酸酶活性的肠道细菌代谢色氨酸产生的产物，为微生物群衍生的芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor ，AHR)配体，该配体通路调节IL-22的表达。然而，直接补充IL-22可能诱发肿瘤的产生，通过研究发现工程改造产生IL-22的罗伊氏乳杆菌可减少脂肪性肝炎和细菌向肝脏的移位[36]。另外，还可以补充IAA，或以肠道微生物作为靶点改善AHR通路，如补充益生菌、AHR配体产生菌或药理性AHR配体，为ALD的治疗带来新的希望[37]。

血清中抗酿酒酵母IgG抗体(anti-Saccharomyces cerevisiae antibodies, ASCA)可以作为机体对真菌或其产物的免疫反应指标。研究发现，AH患者血清ASCA水平明显高于对照组，证明真菌及其产物通过肠道屏障发生移位，并且机体对真菌的免疫反应增强。单变量分析发现，ASCA水平与肝纤维化分期成正相关。此外，血清ASCA的升高与AH患者的死亡率也相关[38]。因此，肠道真菌可作为ALD的治疗靶点，ASCA可用于预测AH患者的预后。

4 结论与展望

近年来，肠道微生态相关研究已经成为许多慢性疾病的研究热点。通过微生物制剂对肠道微生态环境进行修复与改善，保护并增强肠道屏障，进而减少器官损伤和炎症反应。因此，肠道微生态成为治疗慢性肝脏疾病的最新靶点，如酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝病和病毒性肝炎等。但是，由于对肠道菌群的认识和检测方法的限制，目前对肠道菌群的改变以及机制的研究尚未明确。并且由于研究对象、检测区域、检测标本的不同，结果可能具有差异性。因此，未来需要继续深入研究肠道微生物在ALD中的改变，探索与ALD进展相关的特异性微生物，同时寻求ALD特异的肠道微生态相关标志物并通过肠-肝轴治疗ALD。