供者来源性细胞游离DNA在肾移植诊疗中的研究进展与应用

杨洋 张健 林俊

肾移植是终末期肾病的最佳治疗方法，与透析相比，肾移植能提高患者生存率，改善生活质量[1]。随着众多新型免疫抑制剂的出现和使用，术后移植肾短期存活率明显提高，但长期存活率并未显著改善[2]。急性排斥反应（acute rejection，AR）和慢性排斥反应（chronic rejection，CR）仍是影响移植肾长期存活，导致移植肾失功最关键因素[2]。随着移植术后时间的延长，移植肾排斥反应发生率不断增加。免疫抑制不足会增加AR或CR导致的不可逆慢性移植肾失功的风险。然而，术后长期过量应用免疫抑制剂有肾毒性，增加心血管事件、感染和恶性疾病发生的风险，同样影响肾移植受者长期的结局和移植肾存活率。因此，只有更好地对移植术后排斥反应进行早期诊断与监测，才能做到个体化免疫抑制应用，减少移植肾过早丢失，提高受者的生存率。

供者来源性细胞游离DNA（donor-derived cellfree DNA，dd-cfDNA）是指器官移植术后受者循环体液中来源于凋亡或坏死供者细胞的游离DNA，其水平升高往往提示细胞更新和死亡的增加。因此在排斥反应受者体内，dd-cfDNA含量会显著升高。目前，病理学活组织检查（活检）是排斥反应诊断的“金标准”，但由于是有创检查，有着并发症的潜在危险和诊断的滞后性。而通过血清肌酐、尿蛋白、尿量等临床指标反映肾功能同样存在滞后性、灵敏度低、特异度不足等局限。随着近年来对dd-cfDNA研究的不断深入，dd-cfDNA因其具有无创性、灵敏度高和能够对治疗效果进行实时评估等优点受到广泛关注，有望成为器官移植术后新型生物标志物而广泛应用于临床。本文将对目前dd-cfDNA在肾移植中的检测方法，肾移植术后动态变化及其在移植物功能延迟恢复（delayed graft function，DGF）、不同类型排斥反应、BK病毒相关性肾病（BK virus-associated nephropathy，BKVAN）和多种病理生理变化等方面的研究进展与应用进行探讨，为dd-cfDNA未来在肾移植术后的研究与广泛应用提供参考。

1 dd-cfDNA的检测

目前，器官移植中dd-cfDNA的常用检测方法包括实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）、液滴数字PCR和二代测序等[3]。其原理是基于个体间单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）不同的高概率进行检测评估，因此，在没有供、受者基因分型的情况下也可完成dd-cfDNA含量的测定。通过分析SNP的差异，利用二代测序方法区分受者细胞游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）和dd-cfDNA，计算dd-cfDNA含量占总cfDNA含量比例的方法称为浓度法。而液滴数字PCR则可进行cfDNA总量的绝对定量[以每毫升血浆中DNA拷贝数（copies/mL）为单位]，随后用于计算每毫升血浆中dd-cfDNA片段的绝对浓度称为绝对定量法[4]。当前还没有公认的用于器官移植特异性靶向SNP的标准化检测方案，现有研究主要使用的几种商品化的检测方法包括AlloSure、Prospera、TRAC等[5]。最近在肾移植受者中进行的一项研究比较了AlloSure和Prospera两种检测方法，发现两者在预测AR的效力上差异无统计学意义[3]。

2 dd-cfDNA在肾移植术后的动态变化

已有多项研究证实肾移植术后dd-cfDNA呈现时间依赖性的动态变化。Gielis等[6]发现在肾移植术后1 d时中位dd-cfDNA浓度为10.2%，范围在2.6%～41.9%，随后呈指数下降，术后10 d平均值降至0.46%。Shen等[7]比较了7例活体移植受者和14例死亡捐献移植受者术后的dd-cfDNA动态变化，发现移植术后3 h平均dd-cfDNA浓度为20.69%，至16 h为5.22%，术后2 d为1.98%，到术后7 d为0.85%。在肾移植术后的初始阶段和术后7 d内，死亡捐献移植受者中dd-cfDNA的浓度均显著高于活体移植受者（初始阶段45%比10%，术后7 d 1.11%比0.59%），这种差异反映了活体供者环境中肾脏缺血-再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，IRI）较轻，因此由IRI导致的dd-cfDNA产生也较少，表明IRI会增加血浆中dd-cfDNA水平，这也与活体移植结局优于死亡捐献移植相关。

DGF是肾移植术后早期常见的并发症之一，术后预测DGF的发生有助于临床早期鉴别诊断与治疗。目前发现，虽然早期DGF受者与非DGF受者在dd-cfDNA水平上差异无统计学意义，但DGF受者的dd-cfDNA水平下降更为缓慢[7]。也有研究发现，捐献前供者线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）可作为DGF发生的生物标志物，是DGF发生的独立危险因素[8]。捐献前供者血浆中mtDNA水平越高，肾移植术后受者发生DGF的可能性就越大，并且基于供者mtDNA的DGF预测模型曲线下面积（area under the curve，AUC）高达0.93，模型的灵敏度为1.00，特异度为0.78[8]。同时也有研究证实尿中mtDNA水平在DGF患者中也会显著升高[9]。

而在肾移植术后的稳定阶段，dd-cfDNA水平增高可能与AR及引起急性肾损伤的其他原因相关，包括急性肾小管坏死、感染及原肾病复发等[10-13]。并且由于个体之间的变异，即使组织学正常的不同肾移植受者之间dd-cfDNA的基线水平也有差异。有研究显示在肾移植术后2周，dd-cfDNA通常降低至基线水平，中位基线dd-cfDNA浓度为0.21%～0.46%[4,13]。而另一项研究基于肾移植术后97.5%稳定患者的百分位数，设定dd-cfDNA浓度的异常临界阈值为1.2%[14]。一项在303例稳定肾移植受者中进行的dd-cfDNA时程前瞻性系统研究报道，肾移植术后5年内dd-cfDNA浓度可从0.8%增加至2.1%[15]。由于dd-cfDNA存在这种时间依赖性变化，提示我们在肾移植术后不同的时间点应考虑设置不同的dd-cfDNA临界阈值进行临床应用。

3 dd-cfDNA在排斥反应中的研究进展与应用

3.1 dd-cfDNA可作为AR诊断的生物标志物

目前研究普遍认为，血浆中dd-cfDNA浓度为1%时可作为AR受者和稳定受者的检测临界阈值。Sigdel等[16]使用Prospera检测平台回顾性分析了217例穿刺活检匹配的dd-cfDNA样本，其中38例有活动性排斥反应，该方法的AUC为0.87，显著优于估算肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）＜60 mL/（min·1.73 m2） 时 得到的AUC（0.74），诊断灵敏度、特异度、阳性预测值（positive predictive value，PPV）和阴性预测值（negative predictive value，NPV）分别为0.89、0.73、0.52和0.95。另一项前瞻性多中心研究在107例穿刺活检样本中使用AlloSure检测平台评价了dd-cfDNA对于肾移植术后排斥反应的诊断性能[11]。研究发现AR组患者血浆中位dd-cfDNA浓度为1.6%，高于稳定组的0.3%（P＜0.001），以1% dd-cfDNA为阈值诊断AR时AUC为0.74，灵敏度为0.59，特异度为0.85，PPV为0.61，NPV为0.84，而血清肌酐诊断AR的AUC为0.54。值得注意的是，抗体介导的排斥反应（antibody-mediated rejection，AMR）的中位dd-cfDNA浓度为2.9%，而T细胞介导的排斥反应（T cell-mediated rejection，TCMR）的 Banff分级＞ⅠA级时为1.2%；ⅠA级TCMR的平均dd-cfDNA浓度为0.2%，与稳定组相近，远低于1%的检测临界阈值。因此dd-cfDNA对于AMR的诊断性能更好，AUC为0.87，灵敏度为0.81，特异度为0.83，PPV为0.44，NPV为0.96。

鉴于PPV的效能，当dd-cfDNA高于阈值时有可能导致不必要的穿刺活检。但值得肯定的是，较高的NPV保证了dd-cfDNA低于诊断阈值时基本可以排除排斥反应，有助于临床中避免由于血清肌酐升高而进行的阴性活检，体现了dd-cfDNA作为生物标志物具有良好的病理穿刺活检的指导价值。

3.2 不同排斥反应类型dd-cfDNA的差异

以上研究提示不同排斥反应类型的受者dd-cfDNA的水平并不相同。目前研究普遍认可AMR受者dd-cfDNA的水平显著高于稳定组受者，急性与慢性AMR的dd-cfDNA水平差异无统计学意义[12,17]；但是TCMR受者与稳定组受者的dd-cfDNA差异并不明确，中位dd-cfDNA浓度在TCMR组（0.27%）与稳定组（0.38%）之间差异无统计学意义[18]。也有研究发现AMR、TCMR和AMR合并TCMR的ddcfDNA浓度分别为2.2%、2.7%、2.6%，三组间差异无统计学意义[16]。最新荟萃分析也证实在疑似移植肾功能不全的受者中，dd-cfDNA作为诊断AMR生物标志物的效能明显优于TCMR，同时dd-cfDNA对排斥反应（AMR、TCMR或AMR合并TCMR）鉴别的准确性尚有待进一步研究证实[19-20]。造成这一现象的原因可能是不同排斥反应类型的损伤部位并不一致，AMR主要损伤微血管，其造成血管内皮细胞凋亡后产生的dd-cfDNA可以直接进入血液循环。而TCMR，特别是Ⅰ级排斥反应主要炎症损伤局限于肾小管间质，肾小管上皮细胞凋亡后产生的dd-cfDNA入血需要跨过血管屏障。

因此结合目前研究结论，笔者认为dd-cfDNA在诊断TCMR的准确性低于AMR，但是并不代表完全否定dd-cfDNA在诊断TCMR中的意义。Stites等[21]评价了79例已诊断为临界或ⅠA级TCMR受者的dd-cfDNA水平，与dd-cfDNA浓度＜0.5%的受者相比，dd-cfDNA浓度≥0.5%的受者eGFR下降的幅度更大，新生供者特异性抗体（donor specific antibody，DSA）产生率更高，随访活检时持续排斥反应的可能性更高。因此，虽然dd-cfDNA浓度在TCMR中通常不会升高至1%阈值以上，但该研究的意义在于提出dd-cfDNA可作为Banff分级的补充，对活检证实为临界或ⅠA级TCMR的受者进行风险分层。因此即使dd-cfDNA在较低水平，也有助于预测排斥反应和辅助临床决策。同时，对于排斥反应风险的分级和类型的准确诊断与鉴别需要结合其他多种临床指标进行综合判断。例如，有研究发现dd-cfDNA结合DSA检测相比于单独DSA检测，可以显著提高诊断AMR的PPV和NPV[22]。也有学者基于dd-cfDNA、甲基化cfDNA、clusterin、CXC趋化因子配体（CXC chemokine ligand，CXCL）10、血清肌酐和总蛋白制定了量化Q评分体系，将对AR的诊断准确性提高至96%，并且在血清肌酐升高之前就能早期诊断AR[23]。

3.3 dd-cfDNA绝对定量法检测的应用

以上研究结论均是基于二代测序检测后ddcfDNA占总cfDNA含量比例的浓度法得出，然而这种方法的主要缺点在于dd-cfDNA含量受到受者cfDNA含量变化的影响。受者cfDNA主要来自于循环中凋亡的白细胞，感染、出血、药物、运动或心理应激等因素均可导致受者cfDNA含量的变化，从而影响dd-cfDNA的水平[24]。因此，通过液滴数字PCR对dd-cfDNA进行绝对定量的绝对定量法可消除受者cfDNA浓度变异性的影响。研究发现绝对定量法可较好地区分TCMR、AMR以及临界TCMR的受者，而绝对定量法在鉴别活检证实的AR的诊断准确性（AUC=0.83）也优于浓度法（AUC=0.73）[13]。所以笔者认为dd-cfDNA的绝对定量法检测可能是急性AMR更特异的标志物，而浓度法检测可为慢性活动性AMR和重度TCMR提供更多的诊断价值。因此，dd-cfDNA的绝对定量法和浓度法检测的组合应用可提供更为全面的诊断信息。

3.4 AR治疗与dd-cfDNA水平的动态变化

由于cfDNA半衰期较短，一般在0.5～2.0 h即可被机体清除，因此可以对dd-cfDNA进行实时监测，从而反映受者治疗后对药物反应的实时状态[4]。在一项包含5例AMR和23例TCMR受者的研究中发现，dd-cfDNA水平在糖皮质激素静脉滴注的3 d内稳定下降，而在治疗后1、3和6个月后，dd-cfDNA的下降水平与eGFR的改善密切相关[25]。另一项关于儿童肾移植的研究表明，虽然治疗后所有排斥反应类型的dd-cfDNA均会下降，但下降程度因排斥反应类型会有所差别；在AMR和混合排斥反应中，中位dd-cfDNA浓度仍高于1.0%，但在TCMR中可降至0.28%[26]。AR治疗后血浆dd-cfDNA水平迅速下降，表明连续动态的dd-cfDNA监测可作为排斥反应治疗预后的评价指标应用于临床，以预测移植肾的结局。但针对不同排斥反应类型应用不同的治疗方案后，dd-cfDNA的动态变化规律仍需更多的研究来揭示。

3.5 dd-cfDNA检测的适用范围与时间点

dd-cfDNA检测在肾移植中适用于大部分的受者，但是由于dd-cfDNA检测原理的特殊性及局限性，目前暂不支持在如多器官联合移植、未满18岁、既往有骨髓移植、同卵双胞胎移植的受者中使用。需要在移植肾穿刺活检前获得用于dd-cfDNA检测的体液标本，因为穿刺活检本身可以增加dd-cfDNA的水平。一项包括16例成人肾移植受者的研究表明，与活检前水平相比，活检后20 min和2 h时 dd-cfDNA水平均显著增加[27]。而由于cfDNA的半衰期很短，在活检后24～48 h，dd-cfDNA浓度可以恢复到活检前的基线水平。

4 dd-cfDNA在其他肾损伤及移植类型中的研究进展与应用

4.1 dd-cfDNA与BKVAN

BKVAN是导致移植肾功能丧失的常见原因，目前基于尿液和血液的BK病毒DNA载量检测对BKVAN的诊断价值有限。在10例活检和配对dd-cfDNA样本的BK病毒血症或BKVAN患者的研究中发现，与BK病毒血症患者相比，BKVAN患者的dd-cfDNA水平更高（0.58%比3.38%，P=0.001）；并且dd-cfDNA水平与BK病毒载量及BKVAN的组织病理有较好的相关性[28]。也有研究报道了BK病毒感染受者的尿液dd-cfDNA水平升高，并且dd-cfDNA相较于血浆BK病毒载量能更好地用于区分组织学证实或排除的BKVAN[10]。SV40染色为阴性时，对BKVAN和Ⅰ型TCMR之间的鉴别较为困难，因为两者在组织病理学上存在相似性。有研究发现BKVAN患者尿液中dd-cfDNA的绝对值及浓度均显著高于Ⅰ型TCMR受者（10.4 ng/mL比6.1 ng/mL，P＜0.001；68.4%比55.3%，P=0.013）；当尿液dd-cfDNA为7.81 ng/mL作为诊断阈值时，可以将已证实的BKVAN与Ⅰ型TCMR进行有效鉴别（AUC=0.848）[29]。

这些研究结果表明，血液及尿液dd-cfDNA有望作为一种可靠的标志物，联合BK病毒DNA载量检测共同对BKVAN及TCMR进行无创性的诊断，以指导免疫抑制在这两类患者中应用的矛盾。但这仍需要一项前瞻性研究来确定dd-cfDNA是否可以在检测到肾功能下降之前作为BKVAN诊断的早期标志物，以及BK病毒感染期间dd-cfDNA是否可以指导治疗和改变移植物的结局。

4.2 dd-cfDNA与再次肾移植

再次肾移植受者的排斥反应和移植肾丢失的风险将显著增加[30]，因此与单次肾移植受者相比，再次肾移植受者的基线dd-cfDNA水平对于在此类受者中使用该生物标志物至关重要。一项研究显示虽然再次肾移植受者的基线dd-cfDNA浓度略高于单次肾移植受者（0.29%比 0.19%，P＜0.001），但两组的浓度仍显著低于1%的诊断阈值[5]。此外，再次肾移植受者中有排斥反应组dd-cfDNA浓度高于无排斥反应组（1.36%比 0.41%，P=0.009），但与单次肾移植排斥反应受者之间的差异无统计学意义。因此，dd-cfDNA也可作为再次肾移植受者的生物标志物应用于临床诊断。

4.3 dd-cfDNA与多器官移植

目前在肾脏联合其他多器官移植的受者中应用dd-cfDNA检测的报道并不多，因为在多器官移植受者中应用dd-cfDNA最大的难点在于无法确定dd-cfDNA来源的器官。在对稳定的胰肾联合移植受者和心肾联合移植受者进行的两项前期研究中，dd-cfDNA的平均浓度分别为0.19%和0.52%，显著低于1%的诊断阈值[31-32]。而由于肝脏的体积较大，即使在没有移植物排斥反应的情况下，肝移植或者肝肾联合移植受者的dd-cfDNA水平也很高[33]，未来还需更多的研究数据来指导dd-cfDNA在多器官移植受者中的应用。

4.4 dd-cfDNA与其他临床事件

dd-cfDNA与移植物的损伤密切相关，而肾移植术后感染往往可造成移植肾损伤。有研究发现，相比于稳定组受者，存在泌尿系统感染或肾盂肾炎、局部或全身性细菌、真菌、病毒等感染受者的血浆ddcfDNA水平均会升高[34-35]。而在急性肾小管损伤受者中观察到的dd-cfDNA升高的幅度则小得多[11,35]，且无法区分正常和慢性组织学异常，如钙调磷酸酶抑制剂的毒性或间质纤维化或肾小管萎缩等[36]；而尿液中dd-cfDNA水平与蛋白/肌酐比值（r=0.48，P＜0.05）和肾小球滤过指数（r=0.52，P＜0.05）相关，对急性移植肾损伤最为敏感，因此研究者指出尿液dd-cfDNA检测可能是移植肾急性损伤敏感的生物标志物[36]。

也有研究关注dd-cfDNA与长期移植肾功能的相关性，Goh等[37]发现肾移植受者出院时dd-cfDNA水平与1年后血清肌酐水平呈正相关。同样，Zhang等[38]也在移植术后12个月时发现早期dd-cfDNA水平与移植物功能障碍之间的关系，特别是移植术后早期dd-cfDNA水平出现多峰值变化与长期移植物功能障碍相关，这表明急性移植物损伤的反复发作可能损害长期移植肾功能。

Yang等[39]使用上文提到的量化Q评分体系研究了34例IgA肾病患者的尿液样本，发现该评分体系有助于区分健康患者和IgA肾病患者，同时ddcfDNA是最佳的预测因子。较多肾移植受者在术后面临IgA肾病复发的问题，因此该研究提示dd-cfDNA也能作为有效的生物标志物，应用于肾移植术后IgA肾病乃至其他多种肾小球病变复发的监测。

5 小 结

不可否认，dd-cfDNA作为一种无创、敏感，且可反复检测的生物标志物在肾移植术后移植物损伤评估和监测方面有着重要的临床应用价值[40-47]。由于dd-cfDNA较高的灵敏度与NPV，其在排斥反应的早期识别与诊断方面具有优势，可避免过度活检，让诊断与治疗的时间窗提前，可使得临床医师更有针对性地制定个体化免疫抑制剂方案并进行实时监测调整，从而有可能改善肾移植受者的长期预后。然而也正是由于其较高的灵敏度导致多种移植后的病理生理改变均可影响dd-cfDNA的水平，使得dd-cfDNA目前广泛应用于临床还存在诸多局限性。因此进行临床决策时，dd-cfDNA还需结合包括DSA、非人类白细胞抗原抗体、血清肌酐、尿蛋白等指标进行综合分析判断[48-50]。未来我国及世界范围内仍需要大量的前瞻性多中心随机对照研究来确定最佳的dd-cfDNA检测方法、不同疾病状态的诊断阈值、不同免疫抑制剂的影响、与其他生物标志物联合诊断的价值，以及对移植肾和受者长期结局的影响。