山梨醇对黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶(r-Rha1)热稳定性的影响

叶家影， 孙 江， 李文静， 倪 辉*，2，3， 李利君，2，3， 李清彪，2，3

（1.集美大学 海洋食品与生物工程学院，福建 厦门 361021；2.集美大学 福建省食品微生物与酶工程重点实验室，福建 厦门 361021；3.集美大学 厦门市食品生物工程技术研究中心，福建 厦门 361021）

酶在提高生物催化效率的应用中发挥着重要作用，天然酶通常只能根据自身的需要进化相应的催化性能[1]。在工业上使用酶时，需要探索提高其对工业相关底物活性的方法，也应针对这些酶进行工业反应条件的优化。高热稳定性一直是生物催化剂在工业应用中的重要性能，也是限制酶工业化应用的重要因素[2]。酶热稳定性的强弱决定着酶的利用率、生产效率和生产成本[3]等。因此，提高热稳定性是改善工业用酶属性的重要目标。

催化过程中的热环境会加速酶蛋白的变性，为提高酶蛋白的热稳定性，可根据其序列、结构、功能及催化机理进行理性设计，以获得具有良好特性的突变体酶或重组酶[4-7]。在以往的研究中，作者所在团队通过PoPMuSiC算法和α-L-鼠李糖苷酶表面赖氨酸-精氨酸突变提高了α-L-鼠李糖苷酶热稳定性[8-9]。多羟基化合物山梨醇价格低廉、储量丰富，是美国能源部提出的可持续平台化学品之一[10]，在食品、化妆品和医药工业中有广泛用途[11]。随着研究的深入，山梨醇也被广泛用作酶稳定剂[12]。山梨醇作为外源添加剂在提高酶的稳定性方面具有操作简单、成本低及生物降解性良好等优势[13]，Narayanan等研究发现添加山梨醇可缓解酿酒酵母伴侣蛋白突变体的温度敏感性[14]，Mohammadi等发现添加山梨醇可提高羧肽酶A的转变温度（Tm）、活性和稳定性[15]。但目前对山梨醇影响黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶热稳定性机制仍不明确。

α-L-鼠李糖苷酶是一种糖苷水解酶，主要作用于α-1，2、α-1，4、α-1，6糖苷键，能有效水解大多数糖苷末端的带有鼠李糖基团的黄酮类化合物，如橙皮苷、斛皮苷、柚皮苷及人工底物对硝基苯基-α-L-鼠李糖苷（p-nitrophenyl-α-L-rhamnoside，pNPR）等。α-L-鼠李糖苷酶在食品行业有广泛应用，如柑橘果汁的脱苦与澄清[16-17]、饮料香气成分的改善[18]、红酒风味的改善[19]等；此外，在医药行业和化合物的前体合成也有重要应用[20]。但已报道的大多数α-L-鼠李糖苷酶在较高温度下热稳定性差[21-23]，因而限制了其工业应用。已有研究表明，添加山梨醇可增强土曲霉源α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性[24]。作者以黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1为对象，通过热失活动力学、圆二色谱和荧光光谱的谱学分析，探讨山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性影响，并从分子构象及二级结构变化方面研究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶的保护机理，促进人们对山梨醇与α-L-鼠李糖苷酶相互作用的理解，同时为提高其他酶制剂产品稳定性提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种含pPIC9K-rha重组质粒的毕赤酵母SMD1168由集美大学海洋食品与生物工程学院酶工程实验室保藏[25]。

1.1.2 试剂pNPR与甲醇（GR）：Sigma-Aldrich公司产品；山梨醇（AR）：阿拉丁上海有限公司产品；甘油、葡萄糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠：国药集团化学试剂有限公司产品；胰蛋白胨、酵母粉：广东环凯微生物科技有限公司产品；生物素、无氨基酸酵母氮源（yeast nitrogen base without amino acids，YNB）：北京索莱宝生物公司产品。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 （yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：20 g胰蛋白胨、20 g葡萄糖、10 g酵母粉溶解于1 L去离子水中，调节pH至6.0，高压灭菌。

缓冲甘油-复合培养基 （buffered glycerolcomplex medium，BMGY）：20 g胰蛋白胨、10 g酵母粉溶解于700 mL去离子水中，高压灭菌，冷却后加入100 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、100 mL 10×YNB、100 mL甘油、2 mL 0.02 g/dL生物素B。

缓冲甲醇-复合培养基 （buffered methanolcomplex medium，BMMY）：20 g胰蛋白胨、10 g酵母粉溶解于700 mL去离子水中，高压灭菌，冷却后加入100 mL磷酸盐缓冲液（pH 6.0）、100 mL 10×YNB、100 mL甲醇、2 mL 0.02 g/dL生物素B。

1.2 仪器与设备

DK-8D数显恒温水浴锅：常州国华电器有限公司产品；FE20 pH计：瑞士Mettler Toledo公司产品；Avanti J-26S XP立式高速冷冻离心机：美国Beckman公司产品；Infiniti M200 PRO酶标仪：奥地利Tecan公 司 产 品；Sephacryl S-200柱：美 国Amersham Bioscience公司产品；圆二色谱仪：英国Applied Photophsics公司产品；荧光分光光度计：美国PerkinElmer公司产品。

1.3 实验方法

1.3.1 α-L-鼠李糖苷酶酶液的制备、分离和纯化参照刘小琴等的实验方法[26]，将含pPIC9K-rha重组质粒的毕赤酵母SMD1168以1%（体积分数）接种量接入30 mL YPD培养基中。培养14～16 h后，以1%（体积分数）接种量接入100 mL BMGY培养基中，于30℃、180 r/min条件下培养。当OD600为2～5时，离心收集菌体，转移至100 mL BMMY培养基中。培养期间每隔24 h添加体积分数为0.5%的甲醇，作为碳源并诱导菌体表达。诱导表达7 d后，4℃、5 000 r/min离心15 min取上清液，即α-L-鼠李糖苷酶的粗酶液。将上清液进行超滤浓缩（相对分子质量50 000微孔滤膜）后，上样至以20 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH 7.0）平衡的Sephacryl S-200柱中，收集α-L-鼠李糖苷酶组分，于4℃下保存备用。

1.3.2 酶活力测定参照杨岩的实验方法[27]，以20 mmol/L pNPR为底物测定α-L-鼠李糖苷酶酶活性。在20 mmol/L柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 4.0）中，60℃条件下，以每分钟释放1 μmol pNP所需的酶量为1个酶活力单位。60 μL pNPR与120 μL缓冲液在60℃孵育5 min后，加入20 μL酶液，继续在60℃下反应10 min，加入1 mol/L Na2CO3终止反应，于410 nm处测定释放的pNP。

实验组为酶液与等体积山梨醇混合，山梨醇终浓度分别为0.6 mol/L和1.2 mol/L；对照组为酶液与等体积去离子水混合。

1.3.3 热稳定性与热失活分析作者所在实验室前期研究发现，浓度为1.2 mol/L的山梨醇是α-L-鼠李糖苷酶酶活力增强的关键拐点，也是其酶活力的最大峰值处[28]。为了研究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的具体影响，分别测定并绘制了添加1.2 mol/L山梨醇后α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性曲线与热失活曲线的一级动力学模型。

热稳定性曲线：以添加1.2 mol/L山梨醇的酶液为实验组，于60、65、70、75、80℃温育10 min后，按照1.3.2方法测定残余酶活力，以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，并绘制热稳定性曲线。

热失活曲线的一级动力学模型：根据热稳定性实验结果，选取合适温度，按照1.3.2方法测定酶液在不同温度下孵育不同时间的残余酶活力，以ln（At/A0）作图（At为残余酶活力×100，A0为最高酶活力），并进行线性拟合，绘制热失活曲线的一级动力学模型。得到的线性斜率即为该温度下的热失活常数（K），由热失活常数可计算出该温度下的半衰期（t1/2）。

按照1.3.2方法测定残余酶活力，以测得最高酶活力为100%，待残余酶活力降至50%以下，停止测定。60℃下对照组每隔2 h取样测定残余酶活力，实验组每隔1 d取样测定残余酶活力；65℃下对照组每隔10 min取样测定残余酶活力，实验组隔1 h取样测定残余酶活力；70℃下对照组每隔2 min取样测定残余酶活力，实验组每隔10 min取样测定残余酶活力。

1.3.4 圆二色谱分析将分别添加0.6、1.2 mol/L山梨醇的酶液在70℃下温育20 min作为实验组1（0.6 mol/L）、实验组2（1.2 mol/L），未添加山梨醇未温育为对照组，蛋白质质量浓度为0.13 mg/mL，扫描范围为185～260 nm，扫描速率为1 nm/s，分辨率为1 nm。分别记录山梨醇分别添加1.2、0.6 mol/L和未添加时的圆二色谱，最后用Dichrowed分析二级结构，并计算4个二级结构：α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的相对含量。

1.3.5 荧光光谱分析内源荧光分析：蛋白质质量浓度为0.04 mg/mL，测量温度为25℃，激发波长为295 nm，扫描速度为100 nm/min，激发和发射狭缝宽度均为10 nm，波长扫描范围为300～500 nm。分别记录α-L-鼠李糖苷酶在不同温育时间及不同山梨醇添加量的条件下的荧光光谱。

表面疏水活性分析：8-苯胺-1-萘磺酸（8-aniline-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）为荧光探针，蛋白质质量浓度为0.2 mg/mL，测量温度为25℃，激发波长为375 nm，扫描速度为100 nm/min，激发和发射狭缝宽度均为10 nm，波长扫描范围为400～700 nm。分别记录α-L-鼠李糖苷酶在不同温育时间及不同山梨醇添加量的条件下的表面疏水活性。

样品处理：将分别添加0.6、1.2 mol/L山梨醇的酶液在70℃下温育20 min作为实验组1（0.6 mol/L）、实验组2（1.2 mol/L），未添加山梨醇未温育为对照组，不添加山梨醇但温育为未添加组，对α-L-鼠李糖苷酶进行荧光扫描。

1.3.6 数据处理每组实验设3个平行，取平均值，采用GraphPad Prism 8、Excel 2019、Dichrowed软件进行数据处理及相关图表绘制。

2 结果与分析

2.1 热稳定性曲线

酶的热稳定性易受到反应温度、反应体系及其他条件的影响。在作者所在团队前期的研究中发现黑曲霉源α-L-鼠李糖苷酶r-Rha1的最适温度为60℃[25]，分别在60、65、70、75、80℃下测定有无山梨醇条件下该酶的热稳定性曲线，结果如图1所示。在60℃和65℃下，实验组与对照组的相对酶活力无明显差别，在70℃下对照组的相对酶活力仅为13%，而实验组仍可保留98%的相对酶活力。由此可说明山梨醇可有效提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性，这与Pazhang等发现添加山梨醇可提高胰蛋白酶稳定性[12]的研究结果一致。

图1 热稳定性曲线Fig.1 Thermal stability curve

2.2 热失活曲线

酶的热失活是最重要的酶失活形式，热失活曲线反应的酶失活规律是控制与设计工业酶催化反应的必要条件。图2分别为60、65、70℃下的一级热力学模型图。根据图2可计算出α-L-鼠李糖苷酶在不同条件下的热失活常数K和半衰期t1/2，结果如表1所示。在60、65、70℃下未添加山梨醇的α-L-鼠李糖苷酶的半衰期分别为8.08 h、46.52 min、4.34 min，由此可说明α-L-鼠李糖苷酶对于温度十分敏感。山梨醇通过维持蛋白质构象而提高酶的热稳定性，延长半衰期，在60、65、70℃下实验组的半衰期分别是对照组的29、25、10倍。60℃下α-L-鼠李糖苷酶本身已具有较好的热稳定性，65℃下对半衰期的提高效果不如60℃，这符合随着温度的升高酶蛋白半衰期逐步下降的基本规律，也表明山梨醇能有效提高α-L-鼠李糖苷酶的半衰期，这与Ge等发现添加山梨醇可延长曲霉源α-L-鼠李糖苷酶半衰期的结果一致[24]。

表1 酶失活一级动力学模型参数Table 1 Parameters of the first-level kinetic model for enzyme inactivation

图2 热失活曲线的一级动力学模型Fig.2 One-level kinetic model of thermal deactivation curve

2.3 圆二色谱分析

圆二色谱可反映蛋白质的二级结构变化[29]，结果如图3、表2所示，实验组较对照组在192 nm处有较强的正吸收峰，α-螺旋相对含量增加，β-折叠相对含量则相应降低，无规则卷曲相对含量变化小。α-螺旋靠氢键维持稳定，具有一定的刚性，其比例的增加使α-L-鼠李糖苷酶的结构更加刚性。加入山梨醇可保护酶蛋白在变性过程中α-螺旋不被破坏，使α-螺旋、β-折叠和β-转角维持合适比例和稳定的空间构象，从而提高α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性。

图3 圆二色谱图Fig.3 Circular dichroism spectrum

表2 二级结构相对含量Table 2 Secondary structure content table %

2.4 荧光光谱分析

荧光光谱普遍用于蛋白质三级结构研究，因为其内部Trp和Tyr的荧光吸收对各类扰动十分敏感，有研究者就采用荧光光谱法对外源物质与蛋白质的结构变化进行分析研究[30-31]。当Trp和Tyr所处的非极性环境转向极性环境时，多肽链和氨基酸发生去折叠而舒展，酶构象发生改变，引起红移与荧光强度降低。内源荧光结果如图4（a）所示，对照组最大吸收波长为342 nm，实验组中添加1.2 mol/L山梨醇最大吸收波长为344.5 nm，小于未添加及添加量为0.6 mol/L山梨醇的347 nm，红移程度有所下降。表面疏水活性分析结果如图4（b）所示，添加山梨醇的最大吸收波长从488 nm移至486 nm，发生轻微蓝移，荧光强度高于对照组。根据前期实验，α-L-鼠李糖苷酶中山梨醇的最佳用量为1.2 mol/L[28]，但添加0.6 mol/L山梨醇的荧光强度却高于添加1.2 mol/L山梨醇的荧光强度。

图4 荧光光谱Fig.4 Fluorescence chromatogram

作者所在实验室前期对底物pNPR与α-L-鼠李糖苷酶进行分子动力学模拟，发现pNPR结合环附近的Trp253和Trp640对于底物结合十分重要[32]，在α-L-鼠李糖苷酶催化结构域的（α/α）6桶状结构域内部所含Trp和Tyr数量也较多。一般认为，山梨醇可改善酶的热稳定性是由于增强了酶蛋白的疏水作用和氢键数量[33]，且涉及催化结构域周围的氨基酸的氢键对酶和底物之间的接触贡献最大[34]。由内源荧光光谱与表面疏水活性分析推断，添加1.2 mol/L山梨醇的红移程度小于添加量为0.6 mol/L山梨醇，是由于山梨醇的羟基可与水分子、Trp和Tyr侧链形成大量氢键，使疏水氨基酸向内卷曲，扭转Trp和Tyr向更亲水的环境转移，稳定蛋白质构象，进而降低红移程度。山梨醇可在α-L-鼠李糖苷酶分子周围形成致密水化层，减小酶蛋白在热变性过程中的构象变化，维持蛋白质结构的稳定性。而过量山梨醇会与α-L-鼠李糖苷酶活性中心相互作用，进而阻碍酶与底物的结合，故添加0.6 mol/L山梨醇的荧光强度高于添加1.2 mol/L山梨醇的荧光强度。

山梨醇的优先水合作用降低了酶蛋白与水分子的直接相互作用，增强非极性基团间的疏水作用，营造疏水环境[35]，从而提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性[36-37]，其机理图如图5所示。圆二色谱与荧光光谱结果显示山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性产生了影响，与其他研究人员证实山梨醇可通过改变酶蛋白的微环境来提高纤维素酶[37]、β-甘露聚糖酶[38]、α-淀粉酶[39]和β-葡萄糖苷酶[40]等的稳定性结果一致。

图5 山梨醇提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性机理图Fig.5 Mechanism of sorbitol to improve the thermal stability of α-L-rhamnosidase

3 结语

通过分析经山梨醇处理的α-L-鼠李糖苷酶残余酶活力及结构的变化，探究山梨醇对α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的影响。热稳定性及热失活动力学分析表明，在60～70℃下，加入山梨醇提高了α-L-鼠李糖苷酶的热稳定性；在60、65、70℃下，加入1.2 mol/L山梨醇可分别将半衰期提高29、25、10倍。圆二色谱和荧光光谱分析表明，山梨醇可增强α-L-鼠李糖苷酶的表面疏水活性和结构刚性，从而提高其热稳定性。作者解释了山梨醇提高α-L-鼠李糖苷酶热稳定性的分子作用及结构变化机制，为深入理解山梨醇提高酶蛋白稳定性的机理提供了参考；同时进一步验证了山梨醇对增强酶类热稳定性的普遍适用性，为提高酶热稳定性提供了参考方法。