浓香型白酒风味乙酯微生物合成机制研究进展

赵静溶，徐友强，朱华，李微微，陈曦，王红安，李秀婷*

（1.北京工商大学 食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 100048；2.北京工商大学 食品与健康学院，北京 100048；3.北京华都酿酒食品有限责任公司，北京 102212）

白酒是世界著名的六大蒸馏酒之一，也是中国传统发酵食品的重要组成部分[1]。白酒分为12种香型，其中浓香型白酒占白酒市场份额的70%以上，窖香浓郁、香味协调，是传统发酵白酒的典型代表[2]。浓香型白酒生产过程中很多环节仍延续粗放的经验模式，酿造效率低且不同批次产品稳定性差，限制了浓香型白酒品质的提升，其内在科学实质是传统酿造工艺过程中核心功能微生物以及风味物质形成机制不明晰。研究表明，浓香型白酒中酯类物质是重要的风味成分，其中以己酸乙酯为代表的小分子脂肪酸乙酯是浓香型白酒的关键风味化合物[1]。大量研究证实，白酒酿造过程中微生物源酯合成酶催化酸醇酯化反应生成酯类物质是浓香型白酒乙酯合成主要途径[1]，由此可知，厘清酿造过程中脂肪酸乙酯的合成与产酯微生物及酯合成相关酶类之间的相互关系，阐明其有效合成的内在规律，可在一定程度上解析浓香型白酒风味品质改善的根本原因。作者拟从浓香型白酒中乙酯类风味物质的种类、含量以及香气贡献度、产酯微生物、微生物源酯合成酶、酯合成酶结构和催化机制以及其分子改造进行综合分析，以期为解析浓香型白酒风味乙酯化合物有效合成规律进而提升产品品质提供基础数据与科学参考。

1 浓香型白酒风味乙酯种类、含量、香气贡献度

1.1 浓香型白酒风味乙酯种类

浓香型白酒乙酯类物质丰富多样，赋予其水果香、花香以及甜味等香气[3]。到目前为止，共发现风味乙酯114种（见表1），其中直链乙酯有18种，支链乙酯有10种，不饱和乙酯有26种，羟基乙酯有11种，羰基乙酯有18种，二乙酯有9种，环乙酯有3种，芳香乙酯有19种。虽然乙酯种类多样，但并非所有的乙酯对浓香型白酒的风味都至关重要，还需根据其含量和香气贡献度鉴定其对风味的重要性。

表1 浓香型白酒风味乙酯化合物种类Table 1 Types of ethyl ester flavor substances in strong-flavor Baijiu

续表1

1.2 浓香型白酒风味乙酯质量浓度

浓香型白酒中乙酯物质含量的差异是浓香型白酒区别于其他香型白酒，形成独特风格品质的一个重要原因。白酒中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯和乳酸乙酯4种乙酯对白酒的风味具有重要作用，是白酒中的关键风味物质[19]。浓香型白酒中己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯质量浓度分别为400.0～7 606.0、25.4～1 773.0、4.4～1 067.0、45.0～622.0 mg/L[7-8，10，12，20]，可以看出己酸乙酯质量浓度远高于其他3种酯，说明浓香型白酒是以己酸乙酯作为主体复合香的白酒。随着分析技术的发展，除传统意义上的四大乙酯，浓香型白酒中还存在一些前期研究未引起重视的对风味有显著影响的乙酯类物质，比如一些含量在百毫克范围内的乙酯物质（见表2），由于含量相对较高，因此对浓香型白酒酒体风格的呈现具有不可或缺的作用。其他乙酯类物质虽然含量相对较低（见表2），但是可能由于其阈值相对较低，在浓香型白酒的呈香呈味过程中仍具有一定的贡献。因此，酯类物质对风味的重要性，还需根据酯的香气贡献度加以判定。

表2 浓香型白酒风味乙酯化合物质量浓度Table 2 Content of ethyl ester flavor substances in strong-flavor Baijiu

1.3 浓香型白酒风味乙酯香气贡献度

香气贡献度是影响感官的重要指标。酯类的香气贡献度主要取决于两个参数：气味活性值（odor activity values，OAV）和风味稀释 （flavor dilution，FD）因子。一般OAV大于1.0的酯被认为对香气有贡献。浓香型白酒中香气贡献度最大的是己酸乙酯，其次是辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、3-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、4-甲基戊酸乙酯、3-苯丙酸乙酯、癸酸乙酯（见表3），说明浓香型白酒中己酸乙酯、辛酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯等小分子脂肪酸乙酯对浓香型白酒的风味至关重要，各酯之间相互协调，对浓香型白酒的典型风味特征的呈现具有重要影响。白酒发酵过程中原料的带入、发酵过程中的化学转化以及微生物的代谢作用是酯类物质合成的途径，其中复杂的微生物菌群生长代谢是酯类风味物质产生的主要途径[21]。因此，对具有催化合成脂肪酸乙酯能力的核心功能微生物进行分析，对挖掘酯合成微生物提供一定的参考。

表3 浓香型白酒风味乙酯类物质香气贡献度Table 3 Aroma contribution of ethyl ester flavor substances in strong-flavor Baijiu

2 浓香型白酒酿造过程催化风味乙酯合成的重要微生物

研究表明，浓香型白酒发酵过程中共报道508种微生物，其中细菌335种、真菌62种、酵母菌78种、古生菌15种、放线菌18种[1]。值得注意的是，尽管在浓香型白酒中发现了大量微生物，但许多微生物的功能仍有待确定。由于脂肪酸乙酯是浓香型白酒中一类重要的呈香呈味物质，对具有催化合成脂肪酸乙酯能力的核心功能微生物进行总结，可以为浓香型白酒发酵过程中酯类风味物质代谢合成提供参考。具有脂肪酸乙酯合成功能的微生物包括细菌、霉菌和酵母菌等[22]。目前微生物可以通过以下4个途径实现酯化反应[23]（见图1）：利用酸醇酯化反应生成酯，如图1（a）所示；利用半缩醛脱氢生成酯，如图1（b）所示；利用单加氧酶催化2-酮类物质生成酯，如图1（c）所示；利用醇酰基转移酶催化酯合成，如图1（d）所示。白酒发酵过程中，醛酮类物质含量极低，并不是白酒酯合成的主要途径；酵母菌来源的醇酰基转移酶催化酯合成多为清香型白酒产酯主要途径[24]。而白酒发酵过程中含有大量的醇和有机酸，微生物来源酶催化酸醇酯化反应对于发酵过程中酯合成起到重要贡献作用，也是浓香型白酒小分子脂肪酸乙酯风味酯合成的主要途径（见图1（a））。

图1 微生物的乙酯代谢合成途径Fig.1 Microbial metabolic pathways for synthesizing ethyl esters

近期相关细菌和霉菌源酯合成酶催化酸醇酯化反应的研究为浓香型白酒发酵过程酯的合成提供了重要依据。白酒中细菌来源产酯微生物主要有伯克霍尔德氏菌 （Burkholderria sp.）、芽孢杆菌（Bacillus sp.）、拟杆菌（Bacterium sp.）、梭状芽孢杆菌 （Bacillus fusiformis）、葡萄球菌（Staphylococcus sp.）、血红鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sanguinis）等[22]。例如菌株Burkholderia pyrrocinia B1213可以催化乙酸乙酯的合成，其所产酯合成酶BpFae也具有较好的产酯能力[25]。白酒中霉菌来源的产酯微生物主要有黑曲霉（Aspergillus niger）、根霉（Rhizopus sp.）、毛 霉 （Mucor sp.）、 烟 灰 色 曲 霉（Aspergillus fumigatus）、紫色红曲霉（Monascus purpureus）、红色红曲霉（Monascus ruber）等[22]。研究发现菌株黑曲霉CGMCC3.4309具有水相体系高酯合成能力，优化后的菌株可以有效合成戊酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯，转化率分别为7.87%、29.20%、94.80%、85.20%[26]。此外，还有一株紫色红曲霉来源的菌株YJX-8在优化条件下，酯合成酶的酶活力达（1.177±0.009）U/mL[27]。也有研究证实根霉发酵可产酯合成酶，在一定条件下能够催化己酸与乙醇反应生成己酸乙酯，经优化条件后合成的己酸乙酯可达2 302 mg/dL[28]。

相关白酒源微生物，均具有在发酵体系或者酯合成反应的水相体系以脂肪酸和乙醇为前体，催化合成脂肪酸乙酯的能力，表明白酒源发酵体系中存在不同于经典的有机相反应体系催化酯合成的酶资源，可以在水相体系条件下催化脂肪酸乙酯的合成。一株紫色红曲霉YJX-8来源的酯合成酶LIP05具有水相体系酯合成的能力，去除酶的盖子结构酶活力提升，但是并未对其催化机制进行解析[27]。目前对水相体系酶催化合成脂肪酸乙酯的报道较少，酶的催化机制并不明晰。因此对具有酯合成能力的相关酶类进行系统性分析，将有助于为新型水相体系酯合成酶资源的挖掘与利用提供参考。

3 浓香型白酒风味乙酯合成相关酶类

白酒发酵过程中存在大量微生物的生长代谢，是推动物料转化的核心动力。具有产酯能力的微生物分泌的酯合成酶催化白酒酯类风味物质的合成是浓香型白酒发酵过程产酯重要途径[27]。研究表明酯合成酶主要来源于酯酶，属于水解酶类（hydrolases，EC3）。根据国际酶学委员会的标准，酯酶全部列在酯键亚类条目（EC3.1），其中水解羧酸酯键的酶划为EC3.1.1。羧酸酯酶中研究较多的是脂肪酶（EC3.1.1.3）、酯酶（EC3.1.1.1）和角质酶（EC3.1.1.74）[29-30]。该类酶均属于α/β水解酶家族，可以催化酯键的断裂和生成，但在酶的催化特性方面存在一定的差异。

脂肪酶属于α/β水解酶家族，是一种催化长链酰基甘油（酰基链长度≥10个碳原子）水解和合成的羧酸酯酶，在洗涤剂、食品、皮革、造纸、化妆品和生物能源等领域中发挥着重要作用[31-32]。在热力学有利条件下（比如低水分活度的条件）脂肪酶可以催化多种合成反应，可分为酯化反应和酯交换反应两大类[33]。研究发现在动物、植物和微生物中均存在脂肪酶，而大多数研究和工业中使用的脂肪酶都是从微生物中获得的。假丝酵母、黑曲霉、根霉、假单胞菌、链霉菌和碱假单胞菌是一些产脂肪酶能力较强的菌株[34]。根据底物性质的差异，酯酶与脂肪酶的不同之处在于其可以催化中短链酰基甘油（酰基链长度＜10个碳原子）水解和合成。基于氨基酸组成和蛋白质表面静电分布可以对二者进行区分[35]，也可以比较在可溶性酯的水解过程中两种酶的Km值，通常脂肪酶的Km值高于酯酶的Km值[36]。角质酶通常催化角质聚合物中酯键的水解，同时也可以水解长链和短链甘油三酯，但是不需要界面激活作用，与脂肪酶和酯酶具有相似的特性，是目前已知的脂肪酶和酯酶中结构最小的蛋白质，可以降解植物角质，属于丝氨酸酯酶，也可以看作是酯酶和脂肪酶之间的过渡蛋白质，能催化酯聚合物和甘油三酸酯的酯键水解。其来源广泛，许多真菌和细菌中都存在角质酶，其中研究最广泛的是真菌角质酶[37]。

4 酯合成酶结构及催化机制

酶结构是探索酶功能特性，解析酶催化机制以及酶理性设计的基础。目前对于酯合成酶结构的研究多聚焦于酶的核心催化结构域和盖子结构，此外催化活性中心、氧阴离子洞、底物通道以及关键的底物结合位点也成为解析酯合成酶催化机制的核心内容。

4.1 酯合成酶结构

研究发现，大多数酯合成酶属于α/β水解酶家族，其结构主要分为两个部分，一个是核心催化结构域，也叫α/β水解酶折叠结构域，另一个是盖子结构[38-39]。图2所示为酯酶FAEs的蛋白质结构，该酶的蛋白质结构即为标准的α/β水解折叠酶的结构[40]。催化结构域由α-螺旋围绕着8个β-折叠组成，且除第2个β-折叠为反向平行，其余折叠均严格平行排列，为酶的活性位点提供了一个稳定的支架。盖子结构由一些小的α-螺旋组成，位于酶的活性中心之上，其构象的开闭控制着底物进出催化活性中心，是大多数酯合成酶特有的结构域[41]。大部分酯合成酶的催化结构域较相似，均是经典的α/β-折叠结构，差异主要在于α-螺旋和β-折叠的数量（见表4）[42-71]。例如酯酶EprEst催化结构域由5个α-螺旋围绕7个β-折叠组成，其中第1个折叠β1和其他折叠β2～β7反向平行排列，且该结构域与盖子结构之间形成催化裂缝[42]。与其不同的是，酯酶TtEst的催化结构域由序列的1～29和200～275构成，表现为6个α-螺旋围绕8个β-折叠，且第2个β-折叠与其他折叠反向平行[43]。盖子结构、辅酶因子、催化活性中心、氧阴离子洞、底物通道或底物结合位点的差异是造成酯合成酶蛋白质结构差异的一个重要原因，也是影响酶催化特性的重要因素。

表4 酯酶结构特征及催化特性Table 4 Structural characteristics and catalytic properties of esterase

图2 酯酶FAEs蛋白质结构Fig.2 Structure of esterase FAEs

续表4

4.1.1 盖子结构大多数酯合成酶的盖子结构由α-螺旋和β-折叠组成（见表4）。不同酶的盖子结构具有不同的特点，主要表现在组成盖子结构的α-螺旋和β-折叠的数量的多少、盖子结构的有无，以及盖子结构中配位的金属离子和盖子结构位置的不同。酯酶SABP2的盖子结构由3个α-螺旋和3个β-折叠组成[44]（见图3（a）），而酯酶PnbE的盖子结构由5个α-螺旋组成[47]（见图3（b））。 酯酶Cbotu_EstA的蛋白质晶体结构解析表明，该蛋白质的氨基酸残基236～303以及残基334～378组成盖子结构，其中N末端的残基28～63形成一个“臂”，包裹在该盖子结构上，并且发现该蛋白质结构中存在一个Zn2+结合位点，对调节盖子结构构象的改变具有重要作用，同时也是影响酶热稳定性的一个重要因素[58]（见图3（c））。假单胞菌（Pseudomonas sp.）来源的脂肪酶PML中存在由α-螺旋构成的两个盖子结构Lid1和Lid2，当Ca2+存时，Lid1被打开，进而启动Lid2的打开，行使酶的催化功能[72]（见图3（d））。此外，盖子结构在灵活性方面也表现出差异，脂肪酶PEL的盖子结构和催化活性区域之间形成一个“空腔”，且晶体的盖子结构完全无序，说明其盖子结构非常灵活[71]（见图3（e））。不同的是，在脂肪酶AFLB中，盖子结构由一段Loop环构成，盖子上的氨基酸残基Cys273和Cys281之间形成二硫键，限制了盖子的移动[68]（见图3（f））。来源于球形马拉色菌（Malassezia globosa）的脂肪酶SMG1的盖子结构呈一个Loop环构象，而非α-螺旋构象，该结构的移动并不会激活酶的催化功能，但是结构中存在的两个残基Asp278和Asn102可以激活该酶，是负责调节脂肪酶活性和非活性状态的门控机制的关键位点[73]（见图3（g））。与此类似，脂肪酶Mrlip1在行使催化功能时盖子结构上的残基Thr101和Thr107以及“flap”区域的残基Gln282和Phe278引起构象变化，是负责打开和关闭Mrlip1 DAG脂肪酶活性口袋的门控机制的关键位点[74]。某些酶的盖子结构中存在盐桥，例如脂肪酶ReLip盖子结构氨基酸残基Arg291和Glu118之间存在一个盐桥，这种盐桥在其他具有盖子结构的脂肪酶中不保守，且盐桥的存在意味着疏水囊对大体积溶剂具有更高的保护作用，这可能与ReLip对有机溶剂的高耐受性有关，与其他脂肪酶相比，ReLip的盖子也具有一种罕见的性质，即含有5种酸性氨基酸，这有助于增加该酶在酸性条件下的耐受性[75]。研究发现还存在一些非常特殊的不含有盖子结构的酯酶，对于SGNH家族的酯酶，其结构中不含有盖子结构和“nucleophile elbow”，且不具有典型的保守五肽序列，其保守序列表现为GDSL。如酯酶CrmE10由12个α-螺旋和5个β-折叠组成，不含有盖子结构[45]（见图3（h））。

图3 不同酯酶及其盖子结构Fig.3 Different esterases and their respective lid structures

4.1.2 辅酶因子研究证实，少数酯合成相关酶类在催化过程中需要辅酶参与催化过程。革兰氏阴性菌许多酶的折叠和细胞定位依赖于伴侣和分泌系统网络，其中脂肪酶特异性折叠酶Lif作为一种膜结合的立体伴侣，存在一个小的结构域MD1，该结构可以紧密结合并介导脂肪酶LipA的折叠[76]。来源于假单胞菌（Pseudomonas sp.）和洋葱伯克霍尔德氏菌（Burkholderia cepacia）的脂肪酶折叠过程中存在一个巨大的障碍而无法自发正确折叠，研究发现这类脂肪酶中往往存在一个脂肪酶特异折叠酶，该类蛋白质为脂肪酶的立体分子伴侣，帮助脂肪酶越过折叠过程中的能量障碍，为其获得正确构象提供必要空间信息[77]。类似的研究表明伯克霍尔德氏菌来源（Burkholderia glumae）脂肪酶表达需要一个伴侣基因Lif来帮助其折成有活性的构象，且必须同时表达LipA和Lif才能获得有活性的脂肪酶[78]。此外还存在一些自身抑制酶活性的结构，例如华根霉（Rhizopus chinensis）来源脂肪酶N端片段（NTPS）是蛋白质分泌和折叠所必需的一个结构，但是该结构通过与脂肪酶的盖子结构和催化结构域形成保守的相互作用来抑制活性，说明NTPS是一种酶的内部竞争性抑制剂[79]。

4.1.3 催化活性中心催化活性中心是酶催化的关键区域，目前主要通过结构测定以及序列比对的方法以确定酶的催化活性中心。酯合成相关酶类的催化活性中心即催化三联体通常由Ser-His-Asp/Glu组成（见表4）。其中Ser是亲核性残基，位于保守的五肽序列“GX1SX2G”中，His是质子受体/供体，Asp则作为稳定组氨酸的残基。Ser的氧原子和His的氮原子之间形成氢键以稳定亲核残基Ser的构象，而His和Asp的侧链则通过位于β-折叠的羧基边缘的氢键来稳定。脂肪酶CALB的晶体结构解析表明该酶具有经典的催化三联体Ser105-His224-Asp187[80]，与此类似，脂肪酶T1的晶体结构解析，表明该酶的催化三联体为Ser113-His358-Asp317[81]。激素敏感脂肪酶家族的酯酶E40催化三联体为Ser145-His269-Glu239，其中Glu239区别于其他酯酶催化三联体中残基Asp[54]。通常该类酶具有保守五肽序列“GX1SX2G”，然而存在某些酶虽然表现为经典的催化三联体形式，但其保守序列却有所不同。例如酯酶CrmE10的催化三联体为Ser29-His181-Asp178，但其保守序列为“GDSL”[45]；脂肪酶PfL1催化三联体为Ser129-His372-Asp330，而保守序列为“AX1SX2G”[65]，脂肪酶L2保守序列也为“AX1SX2G”型[69]。此外，还存在某些酯酶的催化活性中心并不表现为经典的催化三联体形式。例如首次发现SGNH家族的脂肪酶SrLip活性位点位于疏水结合袋入口前，且催化活性中心由Ser10和His216残基组成催化二联体，其中Ser10的氧原子和His216的氮原子之间形成氢键，亲核的Ser10位于α1螺旋内，His216位于残基192～211形成的Loop环的下方，残基211～213存在一个“转向”，使残基Asn213（相当于其他水解酶催化三联体中的Asp）远离催化位点，表现出该酶以催化二联体作为活性中心[82]；酯酶EprEst的催化活性中心为Ser85-Asp109-Ser214-His242构成的催化四联体形式，具有保守的五肽序列“GHSMG”，位于β4和α3之间形成“nucleophilic elbow”，而其他3个活性残基位于不同的Loop区内，这4个残基通过氢键和盐桥作用进行稳定，残基Ser85的氧原子通过氢键与His242的氮原子相互作用，His242的氮原子与Asp109的氧原子相互作用形成盐桥，而Asp109的侧链氧原子与Ser214相互作用形成氢键，构成稳定的催化四联体活性中心[42]。酶的催化活性中心突变后通常会使酶失活，但也有一些较为有趣的发现，例如以来源于南极假丝酵母的脂肪酶B（CALB）作为带有Ser-His-Asp催化三联体的脂肪酶模型，通过定向进化得到具有Cys-His-Asp催化三联体的高活性半胱氨酸脂肪酶，催化效率较野生型提高40倍[83]。

4.1.4 氧阴离子洞酯合成酶的盖子结构覆盖在酶的催化活性中心，阻止了底物与活性中心的接触。当位于油水界面时，会产生“界面激活”现象，使盖子结构发生构象变化，盖子结构被打开，活性中心暴露出来，底物进入活性中心并与之结合，酶催化活性显著提升。在酶的“盖子”打开的同时，氧阴离子洞也随之形成。氧阴离子洞是酶活性中心“口袋”附近的催化元件，位于丝氨酸羟基周围0.3～0.5 nm，在大多数情况下由来自两个主链酰胺结合羰基氧形成的氢键来稳定四面体中间产物[26]。氧阴离子洞主要表现为3种类型：GGG（X）、G（X）和Y类。其中G（X）类主要包括细菌和真菌脂肪酶、角质酶、磷脂酶和非血红素过氧化物酶。GGG（X）类主要包括细菌酯酶、真菌羧酸酯酶、激素敏感脂肪酶、乙酰胆碱酯酶和硫酯酶等[84]。表4所示为部分已知晶体结构的酯酶的氧阴离子洞，其中酯酶EH3、RmEstB、TmelEST2-3具有保守的氧阴离子洞序列HGGG，酯酶E40、E53、Est22具有保守的HGG序列，而其他酯酶则表现为各自特有的氧阴离子洞序列。酯酶Est4序列分析发现该酶含有一个GGG（X）型的氧阴离子洞[85]。酯酶EstBP7的序列分析发现该酶氧阴离子洞表现为Gly-Gly-Thr，是一种罕见的氧阴离子洞[86]。研究表明红球菌来源的脂肪酶LipR氧阴离子洞表现为Y型，并将这种Y型氧阴离子洞改造为常见的GGG（X）型，发现改造之后酶活力完全丧失，表明LipR的Y型氧阴离子洞是维持酶活性的重要结构[87]。

4.1.5 底物通道和底物结合位点酶催化的过程中存在底物进入到反应区域和产物从反应区域释放的通道，即为底物通道或底物结合口袋。底物到达酶的催化活性区域是催化的第一步，对酶催化过程有着重要影响，甚至有可能成为整个酶催化效率的决定性因素。因此，底物通道是酶催化的关键性区域。此外，一些底物结合位点对于酶行使催化功能具有关键作用，也是酶催化的关键位点。

底物通道的表面通常由疏水性氨基酸组成，并与疏水性底物之间形成相互作用。通常底物通道在疏水相互作用的区域、形状、大小、口袋深度以及氨基酸的理化性质方面有所不同。如表4所示，酯酶EH3的底物通道由3个通道组成，分别为醇通道、酰基通道以及支链酰基通道，3个通道大部分由来自盖子结构和催化结构域的疏水性残基组成，其中酰基通道由残基M115、Y223、W228、L246、I244和L260组成，醇通道由疏水残基F26、L56、M59、M60和M63组成[81]。酯酶RmEstA和RmEstB结构分析表明其底物结合口袋从蛋白质表面延伸到催化残基Ser164约1.1 nm的距离，呈“漏斗状”，被4个α-螺旋和Loop环包围，而RmEstA的底物结合口袋则是一条贯穿整个酶的通道，该通道的入口被5个α-螺旋和Loop环包围，表明不同酯酶的底物通道大小、形状不同[52]。酯酶TmelESTs的蛋白质晶体结构以及催化机制解析得出该酶的底物结合口袋由两个大小不同的通道组成，从亲核残基Ser190延伸到蛋白质的外表面，呈“隧道状”，其中大的通道有两个底物入口，内表面由疏水性和极性残基排列，而另一个小的通道是酰基底物结合通道，内表面由疏水性氨基酸排列[55]。研究表明脂肪酶Yju3p的底物入口通道主要由来自盖子结构的疏水残基和催化结构域的残基组成，且底物在两个结构域之间充当一个“楔子”作用[62]。酯酶EprEst的盖子结构和催化结构域在其界面上形成一个细长的底物结合口袋，从催化中心延伸到蛋白质表面，其中6个芳香氨基酸残基参与了底物和通道入口的形成[42]。酯酶E53催化活性口袋由7个α-螺旋和4个β-折叠组成，催化口袋呈“L”形，该区域包括3个部分：一个是催化中心区域，一个是底物通道入口，一个是底物结合口袋末端区域[57]。酯酶EstDL136则具有一个相对较浅的底物结合口袋，这是因为有3个残基Trp86、Met211和Trp215聚集在活性位点的底部，使得口袋相对较小，因此其最适底物为乙酸对硝基苯酯而不是丁酸对硝基苯酯，而在同源家族的其他酯酶中，该位点处会被其他侧链较小的氨基酸取代，活性口袋较大，因而表现出对长链底物的偏好性，说明活性口袋大小与其底物偏好性有密切关系[53]。

4.2 酯合成酶催化机制

不同来源的酯合成酶在催化合成酯类物质时具有相似的催化机制，其中酯酶遵循经典的Michaelis-Menten动力学方程，具有相对开放的活性位点，而脂肪酶则需要“界面激活”作用，即水不溶性底物（如三酰甘油、脂肪和其他不溶性底物）的羧基酯键在水和低水介质中的水解反应，遵循酶吸附到非均相界面并随后增强脂解活性，定义为“界面活化”[88]。该类酶在行使催化功能时需要经历盖子结构构象的改变，当酶的盖子结构打开，底物分子进入酶的催化活性中心，如图4（a）和图4（b）所示。丝氨酸的侧链羟基氧原子亲核攻击底物的羧基碳原子，电子转移到底物的羧基氧原子上生成氧负离子，并与氧阴离子洞的氢原子形成氢键，维持酶-底物复合物的稳定性；丝氨酸残基的氧原子和底物之间形成共价键产生四面体过渡态1，如图4（b）和图4（c）所示。随后，释放水分子形成酰基丝氨酸，如图4（c）和图4（d）所示。醇进入催化活性中心，醇氧原子攻击酰基丝氨酸的羰基碳原子，形成四面体过渡态2，如图4（e）所示。最后，四面体过渡态2的碳原子与醇的氧原子形成共价键，丝氨酸侧链羟基氧原子与底物碳原子之间的共价键被打破，实现酯化反应，如图4（f）所示[26]。

图4 酶催化酯化反应机制Fig.4 Mechanism of esterification reaction catalyzed by enzyme

明晰酯合成酶催化机制对于指导生产过程中小分子脂肪酸乙酯的有效合成具有十分重要的作用。近年来，许多研究者聚焦于结构分析实现分子改造，通过提升酯酶的催化活性及其稳定性，来获得性能品质更优的酯酶，实现底物的高效转化以及产物的有效合成。

5 酯合成酶的分子改造

目前，酯合成酶的分子改造多聚焦于结构、催化活性中心以及与活性中心紧密联系的底物通道等酶蛋白结构区域，其中盖子结构的去除以及替换、盖子结构上的氨基酸残基以及底物通道或者底物结合位点处的关键氨基酸残基等点突变均为分子改造和催化机制研究的重要内容。表5中总结了目前酯酶的盖子结构以及关键位点突变改造的相关研究[27，89-102]。现有的大量研究通过酯酶形成氢键的氨基酸残基、氢键距离、疏水相互作用以及空间位阻等来分析酶催化的分子机制，进而采用去除或者替换盖子结构的分子改造方法来实现酶作用效率和应用性能的提升。

表5 酯酶分子改造研究文献Table 5 References in esterase molecular modification

6 结 语

风味酯类物质的组成和比例对浓香型白酒的感官品质具有重要影响，其中脂肪酸乙酯因种类丰富和相对含量高，对酒体的感官品质的贡献尤为突出，而浓香型白酒酿造过程中的各类微生物对于酯类物质的生成十分关键。作者在分析浓香型白酒脂肪酸乙酯风味贡献基础上，系统总结了酿造过程酯合成相关的重要微生物以及相关酯合成酶的种类、序列、结构特征等，分析探讨了酯合成酶的催化机制以及相关酶的分子改造研究现状，在一定程度上为明晰浓香型白酒酿造过程中小分子脂肪酸乙酯的有效合成途径提供了新的视角和思路。然而，需要特别关注的是，浓香型白酒酿造过程中，尤其是在酒醅固态发酵阶段，酒醅含水量（质量分数）为53%～58%[32]，微生物与酶生长与作用的重要特征之一是处于水相体系中，这与现有的微生物来源酶催化酯合成在有机介质条件下的理论与机制存在较为显著的区别。因此，进一步深入探讨水相体系酯合成酶催化生成酯类化合物的相关分子机制，不仅能够为科学认知浓香型白酒风味酯的合成途径提供新的基础数据，更可为解析浓香型白酒风味化合物有效合成规律进而提升产品品质提供科学参考。