冠突散囊菌固态发酵对黄芪化学成分和生物活性的影响

陈银翠， 杜 静， 王琪琪， 王云胜， 张传博

(贵州师范大学生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

黄芪可用于治疗糖尿病及其并发症，其主要成分为甘露糖、黄芪甲苷、黄芪皂苷Ⅰ、毛蕊异黄酮葡萄糖苷等，具有补气、止汗、消肿等功效[1-2]。2020年版《中国药典》把黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷作为黄芪药材质量控制的指标性成分，其中黄芪甲苷具有免疫调节、抗炎、抗氧化等作用；毛蕊异黄酮葡萄糖苷具有保护骨骼、改善疲劳等作用[3]。我国古代医学典籍中记载了大量发酵中药炮制品，研究发现，利用微生物发酵中药材，可提高中药材有效成分的产出率和利用率[4]。郭瑞等[5]利用植物乳杆菌发酵黄芪，发现其异黄酮含量增加。尹秀娟等[6]利用芽孢菌发酵黄芪，发现黄芪发酵物能提高猪的胸腺指数和脾脏指数，促进其免疫器官的发育和成长。Qiao等[7-8]利用乳酸杆菌发酵黄芪饲喂肉鸡，发现其对肉鸡的生长、血清生化参数和粪便微生物菌群均有良好改善作用。

冠突散囊菌属于散囊菌属，是在特殊温湿度条件下，茯砖茶通过“发花”工艺滋生的一种天然益生菌，俗称“金花菌”，其能分泌多种胞外酶[9-11]，并可将纤维素和多糖等大分子物质转化成小分子物质。本研究利用冠突散囊菌固态发酵黄芪，促进黄芪有效成分释放和转化，并评价其体外抗氧化活性和降糖作用，以期为进一步开发中药材提供依据。

1 材料

1.1 药物 冠突散囊菌从安化黑茶中分离，经贵州师范大学生命科学学院微生物实验室分离保存。黄芪购自榆林市广济堂中药开发有限责任公司，批号20081902，经专家鉴定为正品，切片后在35 ℃下烘干备用。

1.2 试剂 毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(批号610G021)、黄芪甲苷对照品(批号1226B023，纯度≥98%)、1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，批号W12A9E55779)、抗坏血酸(批号F20130819)、阿卡波糖(批号M13M11K109686)、芦丁(批号1009H022)、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS，批号RH171390)、α-淀粉酶(批号R13O9Y72167)、α-葡萄糖苷酶(批号L24S11Y125689)均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.3 仪器 RE-2000旋转蒸发仪购自上海洪旋实验仪器有限公司；Biotek Epoch2全波长酶标仪购自美国BioTek公司，DH6000II电热恒温培养仪购自天津市泰斯特仪器有限公司；Agilent 1269高效液相色谱仪购自美国Agilent公司。

1.4 培养基 PDA培养基购自山东拓普生物工程有限公司，批号20201015；黄芪基质培养基(黄芪50 g、水40 mL)、大米基质培养基(大米50 g、水40 mL)均为实验室自制，在115 ℃下灭菌30 min。

2 方法

2.1 冠突散囊菌活化和孢子悬浮液制备 使用竹签将冠突散囊菌保存菌种接种于制备好的PDA培养基上，在28 ℃下培养5 d后接种铲刮取菌丝，转移到盛有100 mL无菌水的三角瓶中，28 ℃、120 r/min振荡30 min，血球计数板计数，并稀释成细胞密度为4×106/mL，即得。

2.2 冠突散囊菌固态发酵 按照接种量为培养基质量的5%将冠突散囊菌接种到黄芪基质上，在28 ℃下培养。发酵第6天时，黄芪基质上布满冠突散囊菌菌丝，生长旺盛，即为发酵结束。以灭菌未接菌种黄芪、大米培养基质为对照。

2.3 发酵物提取制备 按照文献[12]报道，将发酵产物置于35 ℃烘箱中烘干后粉碎，称取适量粉末，95%乙醇提取(料液比1∶10)，浸泡过夜，超声提取3次，过滤后收集滤液，35 ℃旋蒸浓缩得浸膏，作为发酵黄芪，以大米培养基和未接种黄芪为对照同法提取，分别作为大米培养冠突散囊菌、未发酵黄芪，将提取物保存在4 ℃冰箱中。

2.4 总黄酮含量测定 采用硝酸铝显色法[13]测定“2.3”项下提取物总黄酮含量，以芦丁为对照品。吸取提取物溶液1 mL，置于10 mL试管中，加5%亚硝酸钠0.5 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝0.5 mL，摇匀，静置6 min，加10%NaOH溶液4 mL，摇匀，静置15 min，吸取200 μL至96孔板中，在510 nm波长处测定吸光度，平行3次，取平均值。

2.5 HPLC分析

2.5.1 供试品溶液制备 取发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌、未发酵黄芪提取物适量，50%甲醇溶解成所需质量浓度，即得。

2.5.2 对照品溶液制备 精密称取黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，置于棕色量瓶中，50%甲醇定容，制成质量浓度为0.2 mg/mL的溶液，即得。

2.5.3 色谱条件 按文献[14]报道，Agilent Zorbax C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相水(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～15 min，81%B；15～25 min，81%～71%B；25～35 min，71%～60%B；35～65 min，60%B～0)；体积流量1 L/min；柱温35 ℃；检测波长210 nm；进样量20 μL。ELSD参数为漂移管温度93.8 ℃；气体体积流量2.7 L/min。

2.6 抗氧化活性、降糖作用研究

2.6.1 清除DPPH自由基 按照文献[12]报道，取发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌提取物适量，50%甲醇稀释成质量浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的溶液，分别在5 mL EP试管中加入1 mL，再加入0.1 mmol/L DPPH溶液1 mL，摇匀，室温避光反应30 min，取200 μL，在517 nm波长处测定吸光度A1；取等体积50%甲醇代替DPPH溶液，在517 nm波长处测定吸光度A2；取等体积50%甲醇代替样品溶液，在517 nm波长处测定吸光度A3。以质量浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的抗坏血酸为阳性对照，平行3次，取平均值，计算DPPH自由基抑制率和IC50值，公式为抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.6.2 清除ABTS自由基 按照文献[15]报道，将7.4 mmol/L ABTS溶液、2.6 mmol/L K2S2O8溶液按1∶1比例混合，室温避光暗处理16 h，乙醇稀释成吸光度为0.70±0.02(734 nm波长处)，现配现用。取发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌提取物适量，50%甲醇稀释成质量浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的溶液，分别取0.1 mL，加入ABTS工作液3.9 mL，充分摇匀，室温避光静置6 min，吸取200 μL，在734 nm波长处测定吸光度A1；取等体积无水乙醇代替ABTS工作液，在734 nm波长处测定吸光度A2；取等体积50%甲醇代替样品溶液，在734 nm波长处测定吸光度A3。以质量浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL的抗坏血酸为阳性对照，平行3次，取平均值，计算各组ABTS自由基抑制率和IC50值，公式为抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.6.3 抑制α-淀粉酶 按照文献[16]报道，取发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌提取物适量，蒸馏水依次溶解稀释成质量浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的溶液，于96孔板中加入PBS溶液40 μL、提取物溶液40 μL、α-淀粉酶溶液20 μL，混匀，在37 ℃下反应10 min，加入可溶性淀粉溶液30 μL，混匀，在37 ℃下反应10 min，加入HCl溶液20 μL，终止反应，最后加入碘液120 μL，混匀，在565 nm波长处测定吸光度A1；取等体积PBS溶液代替淀粉溶液，在565 nm波长处测定吸光度A2；取等体积PBS溶液代替样品和α-淀粉酶溶液，在565 nm波长处测定吸光度A3。以质量浓度为20、10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL的阿卡波糖为阳性对照，平行3次，取平均值，计算α-淀粉酶活性抑制率和IC50值，公式为抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2.6.4 抑制α-葡萄糖苷酶 按照文献[17]报道，取发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌提取物适量，蒸馏水依次溶解稀释成质量浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL，于96孔板中加入PBS溶液145 μL、各提取物溶液15 μL、α-葡萄糖苷酶15 μL，混匀，在37 ℃下反应10 min，加入PNPG 15 μL，混匀，在37 ℃下反应20 min，再加入Na2CO360 μL，在405 nm波长处测定吸光度A1；取等体积PBS溶液取代α-葡萄糖苷酶，在405 nm波长处测定吸光度A2；取等体积PBS溶液取代PNPG，在405 nm波长处测定吸光度A3。以质量浓度为2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL的阿卡波糖为阳性对照，平行3次，取平均值，计算α-葡萄糖苷酶抑制和IC50值，公式为抑制率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

3 结果

3.1 总黄酮含量 冠突散囊菌在黄芪基质上长势良好，在接种的第2天长出少量白色菌丝，第3天白色菌丝明显出现，长势比大米培养基上更快。接种第5天，黄芪基质上生长的黄色菌丝比大米培养基明显，接种第6天冠突散囊菌菌丝完全布满黄芪基质，表明黄芪基质可充分满足冠突散囊菌的生长。以吸光度为纵坐标(A)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=0.939 9X+0.013 2(R2=0.999 2)，在0.1～1 mg/mL范围内线性关系良好。发酵前后，总黄酮平均含量分别为7.11、5.51 mg/g，即发酵后该成分含量更高。

3.2 专属性考察 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷对照品溶液适量，在“2.5.2”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各成分色谱峰明显，附近无其他成分干扰。

3.3 线性关系考察 取“2.5.1”项下对照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，50%甲醇定容至10 mL，在“2.5.2”项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标(Y)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷方程分别为Y=139 930.134 0X+49.669 4(R2=0.999 99)、Y=23 475.091 3X+21.062 2(R2=0.999 90)，在0.02～0.15 mg/mL范围内线性关系良好。

3.4 方法学考察

3.4.1 精密度试验 取“2.5.1”项下对照品溶液，在“2.5.2”项色谱条件下进样测定6次，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷峰面积RSD分别为1.52%、1.35%，表明仪器精密度良好。

3.4.2 重复性试验 按“2.5.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.5.2”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷峰面积RSD分别为0.35%、0.77%，表明该方法重复性良好。

3.4.3 稳定性试验 取“2.5.1”项下供试品溶液，于0、2、4、6、8、10 h在“2.5.2”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷峰面积RSD分别为1.83%、0.91%，表明溶液在10 h内稳定性良好。

3.4.4 加样回收率试验 精密取各成分含量已知的发酵产物，加入0.2 mg/mL对照品溶液，按“2.3”项下方法提取，按“2.5.1”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.5.2”项色谱条件下进样测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、黄芪甲苷平均加样回收率(RSD)分别为100.10%(3.35%)、99.27%(6.25%)。

3.5 色谱分析 图2显示，在相同质量浓度下发酵黄芪比未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌检测出更多成分吸收峰，包括1、2、5、7、9、10、11、13号等新峰；未发酵黄芪与发酵黄芪有重叠峰，如3、4、10号；大米培养冠突散囊菌中上述峰极少，只有16、17号，也是冠突散囊菌特有的。由此可知，在相同质量浓度下，冠突散囊菌发酵前后黄芪中各成分吸收峰强度发生显著变化，甚至出现新的成分吸收峰。

3.6 抗氧化活性、降糖作用

3.6.1 清除DPPH自由基 图3显示，在0.125～4 mg/mL范围内随着质量浓度增加，发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌对DPPH自由基清除能力逐渐增强，在4 mg/mL时三者和抗坏血酸的清除率分别为63.71%、95.42%、95.06%、95.74%，表明冠突散囊菌具有一定的清除DPPH自由基能力；抗坏血酸、发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌IC50值分别为0.009 3、0.250 0、0.559 2、2.661 0 mg/mL，即对DPPH自由基的清除作用依次为抗坏血酸>发酵黄芪>未发酵黄芪>大米培养冠突散囊菌。

3.6.2 清除ABTS自由基 由图4可知，在0.125～4 mg/mL范围内随着质量浓度增加，抗坏血酸、发酵黄芪、未发酵黄芪对ABTS自由基清除率呈升高趋势，其中发酵黄芪比未发酵黄芪更明显，在4 mg/mL时两者清除率分别为84.86%、23.71%；不同质量浓度下大米培养冠突散囊菌清除率都在7.50%左右，表明它基本上不具有清除能力；抗坏血酸、发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌IC50值分别为0.017 1、1.604 7、12.896 7、32.833 3 mg/mL，即对ABTS自由基的清除作用依次为抗坏血酸>发酵黄芪>未发酵黄芪>大米培养冠突散囊菌。

3.6.3 抑制α-淀粉酶 由图5可知，在0.625～20 mg/mL范围内，大米培养冠突散囊菌对α-淀粉酶的抑制平缓稳定，平均抑制率为52.40%，表明它具有一定的抑制能力；阿卡波糖未表现出剂量依赖性，对α-淀粉酶的平均抑制率为55.17%，其原因可能是该药物不稳定，需避光操作，而本实验在配制、测量过程中没有完全达到这一点；随着质量浓度增加，发酵黄芪、未发酵黄芪样品对α-淀粉酶的抑制呈浓度依赖性，以发酵黄芪更明显，表明经冠突散囊菌发酵后可增强黄芪抑制率；发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌、阿卡波糖IC50值分别为1.223 7、2.522 7、2.828 7、6.976 7 mg/mL，即对α-淀粉酶的抑制作用依次为发酵黄芪>未发酵黄芪>大米培养冠突散囊菌>阿卡波糖。

3.6.4 抑制α-葡萄糖苷酶 图6显示，在0.0625～2 mg/mL范围内，抗坏血酸对α-葡萄糖苷酶的抑制率最强，在质量浓度为2 mg/mL时达95.90%；发酵黄芪抑制作用高于未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌，后两者抑制作用相当，表明黄芪发酵后可提高上述活性；阿卡波糖、发酵黄芪、未发酵黄芪、大米培养冠突散囊菌IC50值分别为0.161 9、1.384 7、1.996 3、2.159 7 mg/mL，即对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用依次为阿卡波糖>发酵黄芪>未发酵黄芪>大米培养冠突散囊菌。

4 讨论与结论

冠突散囊菌具有抗氧化、调节糖代谢等功效[18]。本研究利用冠突散囊菌发酵黄芪，发现总黄酮和黄芪甲苷含量较未发酵分别增加了1.29、2.01倍，显著提高了DPPH、ABTS自由基清除率，并能抑制α-淀粉酶和α-葡糖苷酶活性，说明冠突散囊菌发酵对黄芪的生物活性产生了积极作用，推测黄芪经冠突散囊菌发酵后类黄酮、皂苷类及其他未知成分含量提高并有新化合物生成，其对抗氧化活性和降糖作用发挥着重要作用。此外，经HPLC法检测发酵黄芪出现了新的成分吸收峰，如1、2、5、7、8、9、10、11、13号峰，且共同成分吸收峰3、4、10号含量不同，其原因一方面可能是冠突散囊菌分泌某些胞外酶如纤维素酶、果胶酶、氧化酶等使黄芪中大分子细胞壁物质降解，从而使细胞内的黄芪甲苷等活性物质更易于释放[10,19-20]，导致发酵后黄芪甲苷的含量增加；另一方面可能是冠突散囊菌分泌的大量水解酶类将苷元物质分解转化为次级苷或其他苷元物质[21]，具体的转化途径和生成的新化合物还需进一步研究。结果表明，利用微生物发酵中药材，借助其产生的丰富酶系对中药材进行生物转化，这是寻求新化合物和提高中药材有效成分产出率及利用率的有效途径。

自由基参与糖尿病的发生和发展，其表达异常可阻断胰岛素信号传导通路，导致胰岛素抵抗和敏感性降低，致使血糖不断升高，加快糖尿病发生，可通过清除自由基改善胰岛素细胞来治疗糖尿病。Ⅱ型糖尿病最好的治疗策略之一是通过抑制碳水化合物水解酶(如α-淀粉酶和α-葡糖苷酶)来防治餐后高血糖和缓解高胰岛素血症[22]。黄芪具有抗糖尿病、抗炎和抗氧化作用[23-24]，本研究发酵黄芪的成分和含量发生了变化，生物活性也得到了提高，这对研究发酵黄芪的代谢产物和次级代谢产物来寻找新型治糖尿病药物具有重要意义。本课题组后续将对发酵黄芪应用于Ⅱ型糖尿病老鼠进行研究来探讨发酵产物治疗糖尿病及其作用机制，以期为抗糖尿病开发新药提供理论依据。