HPLC-ELSD法同时测定地麦活性糖颗粒中4种糖类成分

张建伟， 刘海燕， 吕海阳， 邓龙飞， 周 啸， 刘 力

(上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021)

生地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的干燥块根，具有清热凉血、养阴生津之功效，用于治疗热入营血、热病伤阴、舌绛烦渴、津伤便秘、内热消渴等症[1]。课题组前期从中提取分离出由水苏糖、棉子糖、甘露三糖等糖类组成的生地低聚糖[2]，具有改善气道病理变化、延缓或逆转COPD发生的作用[3]。另外，生地免煎颗粒可增加2型糖尿病大鼠体质量，显著降低空腹血糖、24 h尿量、尿蛋白等指标[4]。

麦冬为百合科植物麦冬Ophiopogonjaponicus(L. f)Ker-Gawl.的干燥块根，具有养阴生津、润肺清心之功效，用于治疗肺燥干咳、阴虚痨嗽、津伤口渴、内热消渴等症[5]。课题组前期从中分离纯化出麦冬多糖，具有抗心肌缺血[6]、降低血糖、改善胰岛素抵抗的作用[7]。

预实验发现，生地低聚糖、麦冬多糖组合糖具有治疗糖尿病作用，故将两者与可溶性淀粉、微粉硅胶制成地麦活性糖颗粒。本实验采用HPLC-ELSD法[8-9]同时测定地麦活性糖颗粒中果糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖的含量，以期为该制剂质量控制提供依据，也为其临床应用和药效研究奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1100液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)；SEDEX75蒸发光散射检测器(法国SEDEX公司)；TG332A微量电子分析天平、FA2004B电子分析天平(上海精密科技仪器有限公司)；KQ-500DB超声波清洗器仪(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂与药物 果糖(批号100231-201606，纯度99.7%)、蔗糖(批号111507-201704，纯度100%)、水苏糖(批号112031-201701，纯度90.5%)对照品均由中国食品药品检定研究院提供；棉子糖对照品(批号19042322，纯度99.6%)由上海同田生物技术有限公司提供。地麦活性糖颗粒(批号20190913-2)由上海中医药大学附属曙光医院制剂实验室制备。乙腈为色谱纯，由上海安谱实验科技股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 NH2P-50 4E色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-水，梯度洗脱(0～15 min，75%～45%乙腈；15～30 min，45%乙腈)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；蒸发光散射器检测温度40 ℃；采集频率3.125 Hz。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 称取果糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖对照品适量，置于 2 mL量瓶中，超声溶解后定容，摇匀，即得(质量浓度分别为1.314、1.536、1.591、1.888 mg/mL)。

2.2.2 供试品溶液 精密称取本品0.1 g，置于10 mL量瓶中，加适量水超声处理20 min，冷却至室温，加水定容，摇匀，0.45 μm水性微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液 称取麦冬多糖、可溶性淀粉、二氧化硅适量，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.3 专属性考察 精密量取“2.2”项下对照品、供试品、阴性样品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，各糖类分离度均大于1.5，阴性无干扰，表明该方法专属性良好。

1. 果糖 2. 蔗糖 3. 棉子糖 4. 水苏糖

2.4 线性关系考察 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，加水稀释成一定质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品进样量对数为横坐标(X)，峰面积对数为纵坐标(Y)进行回归，并分别以信噪比3∶1、10∶1为定性限、定量限，结果见表1，可知各糖类在各自范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，配制成低、中、高质量浓度，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得果糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖峰面积RSD分别为0.94%～3.82%、1.05%～2.73%、1.23%～2.92%、0.77%～2.79%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.2.1”项下对照品溶液适量，配制成低、中、高质量浓度，于0、24、48 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得48 h内中、高质量浓度溶液中果糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖峰面积RSD分别为1.29%～2.17%、0.61%～1.03%、1.17%～1.49%、0.42%～0.53%；48 h内低质量浓度溶液中四者峰面积RSD均大于5%，而24 h内分别为4.54%、4.59%、2.95%、2.31%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.7 加样回收率试验 参考文献[10]报道，精密称取本品0.1 g至10 mL量瓶中，分别加入50%、100%、150%水平对照品溶液各3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率，结果见表2。

2.8 样品含量测定 称取本品适量，按“2.2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。由此可知，各糖类含量RSD均小于3%。

3 讨论

3.1 检测方法选择 地麦活性糖颗粒中生地低聚糖主要由蔗糖、棉子糖、水苏糖组成[2]，而麦冬多糖由35分子果糖、1分子葡萄糖组成[6]。课题组前期采用蒽酮-硫酸显色法[11]测定总糖含量，发现生地低聚糖在沸水浴条件下显色稳定，重复性好，但麦冬多糖显色不稳定，重复性差，而且颗粒中可溶性淀粉会干扰总糖含量测定。因此，本实验采用HPLC-ELSD法。

3.2 流动相选择 预实验以水、乙腈为流动相，发现在等度洗脱时采用不同流动相比例、体积流量、检测器温度、信号采集频率均不能解决水苏糖裂峰现象，故改为梯度洗脱。结果，随着流动相极性增加，4种糖类的出峰时间缩短，其中果糖峰宽无显著变化，而蔗糖、棉子糖、水苏糖峰宽逐渐减小、峰面积逐渐增大，并且四者分离度良好，水苏糖无裂缝现象。

3.3 提取溶剂、提取时间选择 本实验考察了水、15%乙腈、30%乙腈对4种糖类含量的影响，发现水、15%乙腈提取时四者含量无显著差异；30%乙腈提取时水苏糖含量高于水提时，但3批样品中其差异较大，其原因可能为该成分在乙腈中峰宽小，响应值高，而在有机溶剂中溶解度较小的麦冬多糖、可溶性淀粉会将其包裹，导致其重复性差，不利于提取，为了操作方便、数据稳定可靠，故以水为提取溶剂。同时，考察了提取时间，发现提取15、20、30 min时4种糖类含量无显著差异，最终确定为20 min。

表1 各糖类线性关系

表2 各糖类加样回收率试验结果(n=9)

4 结论

本实验建立HPLC-ELSD法同时测定地麦活性糖颗粒中果糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖含量，该方法无干扰，操作简便，准确度高，重复性好，可有效控制该制剂质量，也可为其他糖类制剂的相关研究提供借鉴。

表3 各糖类含量测定结果(n=6)