基于Q-marker等多维度评价延胡索配方颗粒的质量

张 纯， 范晓良， 陈叶青， 李 雪， 金佩芬

(1.嘉兴市食品药品与产品质量检验检测院中药室，浙江 嘉兴 314001；2.浙江中医药大学附属嘉兴中医院临床药学室，浙江 嘉兴 314001；3.嘉兴学院医学院，浙江 嘉兴 314001)

延胡索为罂粟科植物延胡索CorydalisyanhusuoW. T. Wang 的干燥块茎，功效活血散瘀、利气止痛[1]，其止痛的药效物质基础主要为生物碱[2]，并具有镇静催眠、抗药物成瘾、抗炎、抗缺血、抗溃疡、抗抑郁等作用[3-8]。延胡索配方颗粒是在原饮片基础上直接发展而来的中药配方颗粒，市场需求量巨大，但目前该制剂国家标准中的含量测定指标仅为延胡索乙素[1]，故对其药效关联性较强物质成分群进行质量控制具有重要意义。

2016年，刘昌孝院士首次提出“中药质量标志物”(Q-marker)的概念[9-10]，通过对延胡索系统研究，确定延胡索乙素、延胡索甲素、黄连碱、巴马汀、去氢延胡索甲素、D-四氢药根碱、原阿片碱作为其Q-marker[11]。本实验在此基础上，结合水分、溶化性、浸出物、TLC鉴别、聚类分析、指纹图谱等对延胡索配方颗粒进行多维度评价，以期为该制剂质量控制及标准提升提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Waters e2695-2998高效液相色谱系统，配置DAD检测器(美国Waters公司)；XS205DU电子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；Mili-Q Reference超纯水系统(美国Millipore公司)；C300真空泵(美国圣斯特公司)；KQ-800KDE高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；DGG-9053A电热恒温鼓风干燥箱(上海森信实验仪器有限公司)；暗箱式紫外透射仪(上海宝山顾村电光仪器厂)；薄层色谱板(德国默克公司)。

1.2 试剂与药物D-四氢药根碱(批号AF200527-07，纯度98%)、黄连碱(批号112026-201802，纯度94%)、延胡索甲素(批号AF200519-10，纯度98%)、去氢延胡索甲素(批号AF200415-17，纯度98%)对照品均购自湖南旭瑞中领生物科技有限公司；原阿片碱(批号110853-201805，纯度99.6%)、延胡索乙素(批号110726-201819，纯度99.8%)、盐酸巴马汀(批号110732-201309，纯度95.1%)对照品均购自中国食品药品检定研究院。18批延胡索配方颗粒源于各厂家或医疗机构，具体信息见表1。甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 水分、溶化性测定 按照2020年版《中国药典》四部通则0832水分测定第二法(烘干法)及通则0104溶化性检查相关规定进行测定，测得18批样品中水分为2.59%～6.24%，均符合药典要求(水分不大于8.0%)，并且均无焦屑等异物。

2.2 浸出物测定 本品研细，取约2 g，精密称定，精密加入100 mL乙醇，按照2020年版《中国药典》四部通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法进行测定，测得18批样品中浸出物为10.39%～27.70%，符合试点统一标准(浸出物不少于10.0%)。

2.3 TLC定性鉴别 取本品0.5 g，研细，加70%甲醇50 mL，超声处理30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加10 mL水溶解，浓氨试液调pH至碱性，乙醚振摇提取3次，每次10 mL，合并乙醚液，蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为供试品溶液；取延胡索对照药材1 g，同法制成对照药材溶液；取延胡索乙素对照品适量，甲醇制成每1 mL含0.5 mg该成分的对照品溶液。以甲苯-丙酮(9∶1)为展开剂二次展开，取出晾干后碘蒸气显色，在365 nm紫外灯下检视，结果见图1。由此可知，主斑点清晰，分离度良好，与对照药材、对照品在相同位置处显示相同颜色的斑点。

注：D为延胡索，T为延胡索乙素对照品。

2.4 HPLC指纹图谱建立

2.4.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(含0.08%三乙胺)(B)，梯度洗脱(0～10 min，90%～87%B；10～65 min，87%～75%B；65～66 min，75%～15%B；66～80 min，15%B)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长280 nm；进样量10 μL。

2.4.2 供试品溶液制备 取本品适量，研细，精密称取粉末0.2 g，置于150 mL锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，在30 ℃恒温下超声(250 W、40 kHz)处理25 min，放冷，70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.4.3 方法学考察 以6号峰(延胡索乙素)为参照(S)，取供试品溶液适量，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定6次，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.50%，相对峰面积RSD<2.5%，表明仪器精密度良好。取本品适量，按“2.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.50%，相对峰面积RSD<3.0%，表明该方法重复性良好。取供试品溶液适量，于0、3、6、12、24、36、48 h在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得各共有峰相对保留时间RSD<0.50%，相对峰面积RSD<2.0%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.4.4 图谱生成 取18批样品，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，将数据导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以S1为参照图谱，中位数法生成对照图谱，设定时间窗宽度为0.5，采用多点校正，见图2，发现有15个共有峰，相似度见表2，可知在0.981～1.000范围内，符合指纹图谱要求。以6号峰(延胡索乙素)为参照(S)，测得各共有峰相对保留时间RSD为0.12%～0.97%，相对峰面积RSD为23.3%～51.5%，表明不同厂家、批次样品成分组成一致，但在含量上存在差异。

图2 18批样品HPLC指纹图谱

表2 18批样品相似度

2.4.5 聚类分析 以共有峰峰面积与称样量比值为变量，采用组间连接法，以平方欧式距离为测量度进行聚类分析[12-14]，结果见图3。由此可知，各批样品聚为4类，其中S1～S2、S3～S4、S12～S17各自聚类，而其余厂家样品较分散。

图3 18批样品聚类分析树状图

2.5 含量测定

2.5.1 对照品溶液制备 取D-四氢药根碱、原阿片碱、延胡索乙素、黄连碱、延胡索甲素、盐酸巴马汀、去氢延胡索甲素对照品适量，70%甲醇制成质量浓度分别为0.084 4、0.168 5、0.960 1、0.266 7、0.247 9、0.133 6、0.699 4 mg/mL的溶液，即得。

2.5.2 供试品、阴性样品溶液制备 同“2.4.2”项。

2.5.3 色谱条件 同“2.4.1”项，色谱图见图4。

2.5.4 线性关系考察 将对照品溶液稀释成系列质量浓度，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，并以信噪比(S/N)10∶1为定量限，3∶1为检测限，结果见表3，可知在各自范围内线性关系良好。

1.D-四氢药根碱 2.原阿片碱 3.延胡索乙素 4.黄连碱 5.延胡索甲素 6.盐酸巴马汀 7.去氢延胡索甲素1.D-tetrahydrojatrorrhizine 2.protopine 3.tetrahydropalmatine4.coptisine 5.corydaline 6.palmatine 7.dehydrocorydaline

表3 各成分线性关系

2.5.5 方法学考察

2.5.5.1 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定6次，测得D-四氢药根碱、原阿片碱、延胡索乙素、黄连碱、延胡索甲素、盐酸巴马汀、去氢延胡索甲素峰面积RSD分别为1.89%、1.81%、1.62%、1.90%、1.63%、1.71%、1.87%，表明仪器精密度良好。

2.5.5.2 重复性试验 取本品(批号1909001C)适量，按“2.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得D-四氢药根碱、原阿片碱、延胡索乙素、黄连碱、延胡索甲素、盐酸巴马汀、去氢延胡索甲素含量RSD分别为0.84%、1.36%、1.08%、0.98%、0.99%、1.38%、1.83%，表明该方法重复性良好。

2.5.5.3 稳定性试验 取供试品溶液(批号1909001C)适量，于0、3、6、12、24、36、48 h在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，测得D-四氢药根碱、原阿片碱、延胡索乙素、黄连碱、延胡索甲素、盐酸巴马汀、去氢延胡索甲素峰面积RSD分别为1.14%、1.02%、0.79%、1.45%、1.68%、1.41%、1.10%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

2.5.5.4 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的本品(批号1909001C)6份，每份0.1 g，置于150 mL锥形瓶中，精密加入对照品溶液1 mL，按 “2.4.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，D-四氢药根碱、原阿片碱、延胡索乙素、黄连碱、延胡索甲素、盐酸巴马汀、去氢延胡索甲素平均加样回收率分别为97.81%、101.53%、99.71%、102.33%、98.97%、101.63%、100.85%，RSD分别为1.59%、1.06%、0.83%、0.95%、1.38%、1.88%、0.89%。

2.5.6 样品含量测定 取18批样品，按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.4.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(mg/g)

3 讨论

目前，虽然国家先后颁布了近200种中药配方颗粒的质量标准[15-16]，但其质量和标准问题仍是未来急需应对的两大挑战[17]。《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》规定，中药配方颗粒除符合2020年版《中国药典》对颗粒剂的通则要求外，还应具备汤剂基本属性。Q-marker作为反映中药安全性和有效性的标识性物质[18]，完全符合上述理念，可有效反映从汤剂到配方颗粒药效物质成分的传递，可用于中药配方颗粒的质量评价。

本实验发现，18批延胡索配方颗粒水分、溶化性、浸出物检测结果均符合2020年版《中国药典》及配方颗粒试点统一标准的规定；TLC鉴别方法灵敏度高，分离度好；各批样品相似度较好，在主要成分组成上具有较高的一致性，但其含量存在一定差异，特别是7个Q-marker，其中来源于广东某公司生产的6批样品较小，在聚类分析中也归为一类，表明其质量较稳定，而部分厂家样品聚类较分散，需引起关注。

4 结论

本实验对延胡索配方颗粒质量进行多维度全面评价，所建立的方法准确可靠，简便可行，可为该制剂质量控制提供参考依据。