菊花提取工艺的优化

夏 玲， 周桂生， 严 辉， 伊艳玲， 李海洋， 吴励萍， 谢 红， 魏丹丹， 段金廒

(南京中医药大学，中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023)

菊花为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.的干燥头状花序，功效清热解毒、平肝明目、散风清热[1]，含有丰富的黄酮、酚酸、生物碱、萜类、挥发油、多糖等成分[2-5]，具有抗炎、免疫调节、抗氧化、抗菌、抗病原微生物、调节心血管功能等多种药理活性[6-7]。文献[8-9]报道了采用响应面试验优化菊花中挥发油、总黄酮提取工艺，以及抗氧化活性评价[10]，但尚无结合浸膏得率、化学成分、活性实验综合评价提取工艺的研究。因此，本实验结合总黄酮含量[11-12]、浸膏得率、总抗菌活性评分来优化菊花提取工艺，以期实现该植物高值化利用，提升资源利用效率，并为相关产品的进一步开发提供指导。

1 材料

1.1 植物 菊花于2020年10月采自江苏省盐城市射阳县洋马镇，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为菊科植物菊ChrysanthemummorifoliumRamat.。

1.2 菌种 金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC 25923)、大肠杆菌Escherichiacoli(ATCC 8739)，均来自广东省微生物研究所。

1.3 试剂与药物 芦丁对照品(南京良纬生物科技有限公司，批号lw18012501)。青霉素G钠(罗恩试剂)；氯霉素(阿拉丁试剂上海有限公司)；琼脂粉、2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)、胰蛋白胨、酵母粉(上海源叶生物科技有限公司)；氯化钠(南京化学试剂有限公司)。无水乙醇、甲醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯；水为蒸馏水(实验室自制)。

1.4 仪器 Labcanco真空冷冻干燥机(北京照生行仪器设备有限公司)；SX-700立式高压灭菌锅(上海天美科学仪器有限公司)；超净工作台(上海宝赛生物科技有限公司)；IS-rDV1生化培养箱(美国精骐有限公司)；EPED-E2-30TF实验室级超纯水器(南京易普易达科技发展有限公司)；UV-2000紫外-可见光分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)；电子天平[万分之一，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 浸膏得率测定 取1 mL药液至离心管(质量为A)中，浓缩得干浸膏(质量为B)，计算得率，公式为得率=[(B-A)V/M]×100%[13]，其中V为样品总体积，M为生药量。

2.2 提取工艺

2.2.1 单因素试验 以乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)为影响因素，总黄酮含量为评价指标，因素水平见表1。

表1 单因素试验因素水平

2.2.2 Box-Behnken响应面法 在单因素试验基础上，以乙醇体积分数(A)、料液比(B)、提取时间(C)为影响因素，总黄酮含量、浸膏得率、总抗菌活性评分的综合评分为评价指标，建立17组试验，采用Design Expert 8.0.6软件进行响应面分析，每组3份，取平均值。

2.3 总黄酮含量测定

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取芦丁对照品40 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解稀释至刻度，混匀，即得(质量浓度为0.40 mg/mL)，在4 ℃下保存。

2.3.2 供试品溶液制备 取药材粉末约3.0 g，精密称定，置于100 mL锥形瓶中，按照一定料液比加入乙醇，称定质量，在80 ℃下回流提取2 h，放冷，乙醇补足减失的质量，重复1次，合并提取液，13 000 r/min离心15 min，取上清液，即得，置于4 ℃冰箱中保存。

2.3.3 线性关系考察 精密吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL对照品溶液，置于10 mL离心管中，纯水补足至2.0 mL，摇匀，加5%硝酸钠溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加4%NaOH溶液(1 mol/L)5 mL，静置15 min，以相应试剂为空白对照，采用紫外分光光度计在510 nm波长处测定吸光度。以吸光度为纵坐标(A)，对照品质量浓度为横坐标(X)进行回归，得方程为A=2.862 2X-0.017 1(R2=0.997 9)。

2.4 抗菌活性测定

2.4.1 菌悬液制备 将冻存于-80 ℃冰箱中的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌置于37 ℃水浴中解冻，表面消毒后置于超净工作台，轻轻吹打均匀后移取100 μL菌液至5 mL LB液体培养基中，置于37 ℃恒温培养箱中培养18～24 h。将活化菌株接种在LB固体培养基中，在37 ℃下活化培养18～24 h，并挑取单个菌落接种于LB液体培养基进行扩大培养，置于37 ℃恒温培养箱中振荡培养12 h，取对数生长期者，采用灭菌空白培养基校正菌液，使其浓度约为1×106～1×107CFU/mL。

2.4.2 供试品溶液制备 取药液适量，挥干乙醇后置于冻干机中冻干成粉末，精密称取适量溶于无菌水中，即得(质量浓度为60 mg/mL)。

2.4.3 最小抑菌浓度(MIC)测定 在96孔聚苯乙烯板中的第1排加入药液、LB液体培养基各50 μL，吸打混匀，第2排加入药液67 μL、LB液体培养基133 μL，于第3、4排中每孔加100 μL LB液体培养基，第2排每孔取100 μL加至第3排，再从第3排每孔取100 μL加至第4排，将药液稀释至15～2.5 mg/mL，以不加药液为空白对照，大肠杆菌以氯霉素为阳性对照，金黄色葡萄球菌以青霉素G钠为阳性对照。最后，每孔加入含菌株的混悬液100 μL(浓度约为1×106CFU/mL)，置于37 ℃培养箱中培养18～24 h，加入0.01% TTC溶液再培养2 h，以不显红色的最低浓度为MIC，平行3次，每次3个复孔，取平均值。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 精密度试验 精密吸取1.0 mL对照品溶液，按“2.3.3”项下方法测定6次吸光度，测得其RSD为0.03%，表明仪器精密度良好。

3.1.2 重复性试验 称取药材6份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD为1.60%，表明该方法重复性良好。

3.1.3 稳定性试验 称取同一份药材，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，于0、4、8、12、24、48 h按“2.3.3”项下方法测定吸光度，测得其RSD为1.91%，表明溶液在48 h内稳定性良好。

3.1.4 加样回收率试验 取总黄酮含量已知的药材6份，精密加入芦丁对照品适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3.3”项下方法测定吸光度，计算回收率。结果，总黄酮平均加样回收率为101.3%，RSD为2.03%。

3.2 单因素试验

3.2.1 乙醇体积分数 固定料液比为1∶15，提取时间为1.5 h，提取次数为2次，考察乙醇体积分数40%、50%、60%、70%、80%对总黄酮含量的影响，结果见图1。由此可知，随着乙醇体积分数增加，总黄酮含量呈先升后降的趋势，在60%时最高，故选择60%作为乙醇体积分数。

图1 乙醇体积分数对总黄酮含量的影响

3.2.2 料液比 固定乙醇体积分数为70%，提取时间为2 h，提取次数为2次，考察料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30对总黄酮含量的影响，结果见图2。由此可知，随着料液比增加，总黄酮含量呈先升后降的趋势，在1∶20时最高，故选择1∶20作为料液比。

图2 料液比对总黄酮含量的影响

3.2.3 提取时间 固定乙醇体积分数为70%，料液比为1∶20，提取次数为2次，考察提取时间0.5、1、1.5、2、

2.5 h对总黄酮含量的影响，结果见图3。由此可知，提取1.5 h时总黄酮含量最高，故选择1.5 h作为提取时间。

图3 提取时间对总黄酮含量的影响

3.3 抗菌活性实验 分别对不同提取工艺下药液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的MIC进行评分(MIC≤2.5 mg/mL，4分；2.5 mg/mL10 mg/mL，1分)，重复3次，取平均值，最后将两者求和，得到总抗菌活性评分，结果见表2。

表2 抗菌活性实验结果(分，n=3)

3.4 Box-Behnken响应面法 在单因素试验基础上，根据Box-Behnken设计原理作进一步优化，因素水平见表3。以综合评分H为评价指标[14]，计算公式为Hi=ΣWj×Hij*，其中Hi为第i号试验的总综合评分，Wj为权重(浸膏得率权重为0.3，总黄酮含量权重为0.4，抗菌活性权重为0.3)[15]，Hij为第i号试验j项指标消除量纲后的评分；Hij*=[(Hij-Hjmin)×100]/(Hjmax-Hjmin)，其中Hij为第i号试验j项指标测量值，Hjmax为第j项指标中的最大值，Hjmin为第j项指标中的最小值，结果见表4。

表3 Box-Behnken响应面法因素水平

表4 Box-Behnken响应面法设计与结果(n=3)

表5 方差分析

响应面分析[18]见图4，可知BC响应曲面较AB、AC更陡峭，即其交互作用更显著，与方差分析结果一致。

图4 各因素响应面图

3.5 验证试验 通过Design-Expert8.0.6软件得到最优工艺为乙醇体积分数50%，料液比1∶25，提取时间74.4 min，提取次数2次，综合评分为72.657分，考虑到实际操作可行性，将其修正为乙醇体积分数50%，料液比1∶25，提取时间75 min，提取次数2次，再进行3批验证试验，结果见表6。由此可知，浸膏得率、总黄酮含量较高，抗菌活性较强，表明该工艺稳定可靠。

表6 验证试验结果(n=3)

4 讨论与结论

目前，提取工艺优化的主要方法有正交设计、均匀设计、Box-Behnken响应面法等，其中Box-Behnken响应面法结合了数学建模和试验设计，不包含所有因素同时处于其最高或最低水平的组合，可避免一些极端值，如今广泛应用于中药提取工艺优化中[19-20]。本实验发现，菊花对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有一定抑制作用，并且不同提取条件下其抗菌活性存在一定差距；最优提取工艺为乙醇体积分数50%，料液比1∶25，提取时间75 min，浸膏得率、总黄酮含量较高，抗菌活性强，表明Box-Behnken响应面法稳定可行，弥补了该植物优化抗菌工艺的空白，可为后续基于抗菌功效的相关产品开发奠定理论依据和实践基础。