食品中蜡样芽孢杆菌检测技术应用进展

◎ 种 婷

（辽宁省检验检测认证中心，辽宁 沈阳 110032）

1 蜡样芽孢杆菌的危害

蜡样芽孢杆菌是一种产芽孢的革兰氏阳性杆菌，是一种条件致病菌，自然界中广泛存在，其产生的内生孢子对外界不良环境有很强的抵抗力，对高温、酸碱不敏感[1]。蜡样芽孢杆菌分为产毒株和不产毒株，不产毒株是一种有益菌，被用于植物种植和动物饲养，但产毒株却给食品安全和人们的身体健康带来了严重的危害[2-3]。

2017年，中国疾病预防控制中心卫生应急中心发布的食物中毒事件数据显示，由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件占食物中毒事件总数和中毒总人数的1.72%（6/348）和3.63%（268/7 389），仅次于细菌性食物中毒、沙门氏菌、副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌肠毒素，位列第五[4]。2017—2019年，辽宁省共采集12类4 694份样品进行食源性致病菌检测分析，蜡样芽孢杆菌在第二季度检出率最高为16.92%[5]。2018—2020年，宝鸡采集辖区内12个县区6类食品187份样品进行检测分析，结果检出33株蜡样芽孢杆菌，检出率为17.65%[6]。在腐乳[7]、婴幼儿食品[8]、蜂蜜[9]、湿粉类制品[10]和米饭和肉制品[11]等食品中均检出过蜡样芽孢杆菌。产毒株按照食物中毒症状分为呕吐型和腹泻型两种，其分泌的毒素耐高温、耐高压，在食品加工过程中不能被分解，人们误食被其污染的食品会引起呕吐或者腹泻，严重者还会死亡[12]。由此可见，快速、准确地检测蜡样芽孢杆菌具有重要意义，本文对检测蜡样芽孢杆菌的方法进行总结概括，以期为快速检测鉴定蜡样芽孢杆菌提供思路，为食品安全监管提供依据。

2 免疫学检测法

ZHU等[13]研发出一种快速检测肉制品中蜡样芽孢杆菌的特异性双抗体夹心酶联免疫吸附法。采用辛酸/饱和硫酸铵沉淀法和蛋白A-sepharose柱分别从兔抗血清和小鼠腹水中制备蜡样芽孢杆菌特异性多克隆抗体（Polyclonal Antibody，pAb）和单克隆抗体（Monoclonal Antibodies，MAB），检测限（Limit of Detection，LOD）为9×102CFU·mL-1。样品中含有多种致病菌时，该方法能够快速准确地检测到蜡样芽孢杆菌。酶联免疫法的优点是高通量，但对底物颜色有要求，否则会影响结果判读。

3 分子生物学检测法

3.1 实时荧光PCR法

杨滴等[14]建立了一种实时荧光PCR法，检测肉制品中蜡样芽孢杆菌，通过对蕈状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等20株细菌检测，特异性良好，蜡样芽孢杆菌检出限为1×103CFU·mL-1。HANSEN等[15]提出一种检测蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌肠毒素编码基因的方法，该方法检测HBL和NHE操纵子基因的6套引物以及用于检测BCET的BCET1、BCET3和BCET4引物的PCR分析。

3.2 多重PCR法

刘芳等[16]采用多重实时荧光PCR法设计了与肠毒素相关的三重HBL A、HBL C、HBL D基因，非溶血性肠毒素三重NHE A、NHE B、NHE C基因，呕吐毒素、肠毒素、细胞毒素三重CES、ENT FM、BCE T基因检测蜡样芽孢杆菌毒力基因。实验结果显示特异性较好，检出限可达到63 CFU·mL-1。刘秀峰等[17]建立多重PCR方法同时检测蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）的HBL A、HBL C、NHE A、NHE B、CYT K、CER、ENT FM、BCE T基因和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的CRY基因。试验发现CRY基因可作鉴别基因用来区分蜡样芽孢杆菌和苏云金蜡样芽孢杆菌，大大缩短了蜡样芽孢杆菌的检验周期。

3.3 环介导等温扩增法

张童等[18]通过对5组引物进行特异性、灵敏度测试后，选出性能较好的1组引物，并对其进行优化，从而建立一种环介导恒温扩增法检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌。将蜡样芽孢杆菌混入牛乳进行检测，菌量在2.1×102CFU·mL-1时即可被检出。徐晓可等[19]建立针对呕吐毒素CES B基因检测蜡样芽孢杆菌的环介等温扩增法（Loop-mediated Isothermal Amplification ，LAMP），特异性强，灵敏度为5.0×103CFU·mL-1。采用此法检测被蜡样芽孢杆菌污染的食品，当蜡样芽孢杆菌菌量超过103CFU·g-1时即可被检出。贾雅菁等[20]采用实时荧光与环介导等温扩增技术相结合的方式，对蜡样芽孢杆菌溶血素HBL A基因进行鉴定，该方法比普通环介导等温扩增法灵敏度高10倍，灵敏度可达 8.2 CFU·mL-1。

3.4 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法

ULRICH等[21]等用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法对121株芽孢杆菌（m/z为800～1 800 Da）进行测量，使用ClinProTools 3.0统计软件和Flex分析软件（德国Bruker Daltonics GmbH），评估两种特定的生物标记物（m/z分别为1 171 Da和1 187 Da），可以区分呕吐型和非呕吐型蜡样芽孢杆菌，识别正确率为99.1%。KRZYSZTOF等[22]采用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析完整细胞，对呕吐型和非呕吐型蜡样芽孢杆菌进行鉴定。34株蜡样芽孢杆菌呕吐型菌株和88株非呕吐型菌株（包括蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、魏氏芽孢杆菌和类霉菌芽孢杆菌）的系统蛋白质组聚类显示，两组之间的相似性水平为43%，且呕吐型菌株之间有高度相关性（相似性为78%）。

4 结语

蜡样芽孢杆菌传统方法检验周期长，检验过程复杂烦琐，且对检验员的能力与经验要求高。酶联免疫吸附法特异性强，高通量，检测周期短，所需仪器设备仅为一般实验室常备仪器，缺点是不能实时检测。实时荧光PCR操作简单，检测时间短，由于蜡样芽孢杆菌毒力基因多，仅对其中一个毒力基因进行检测准确率低，有假阳性和漏检的情况。多重PCR可同时检测多个目标基因，检验效率高，但易出现交叉反应，造成假阳性。环介导等温扩增法操作简单，适用于现场快速检测，引物设计时要关注其特异性，否则易导致非特异性扩增。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱是近年来新兴的一种以蛋白质指纹图谱为基准的鉴定方式，具有鉴定时间短、通量高、后续费用低等特点，但所用仪器设备价格昂贵，对其发展有所制约。以上检验方法各自有优缺点，应根据实际检测要求选择合适的检测方法，从而使每种检测方法的优点最大化。