响应面法优化Fenton试剂脱色考马斯亮蓝G-250废液

卢建发 ,邓 彬 ,黄冰晴 ,张国广 ,邹金美*

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州 363000；2.闽台特色园林植物福建省高校重点实验室,福建漳州 363000）

在蛋白质样品定量测定的方法中，一种较为常用的方法是考马斯亮蓝G-250（G-250）测定法.其基本原理是：G-250 在游离状态下呈现红色，在酸性条件下，考马斯亮蓝G-250 与蛋白质的疏水区之间有亲和力，结合后变为青色，故可用于蛋白质浓度的测定[1].G250测蛋白后的废液存在色度大和pH 值低的特点，必须收集后做无害化处理.

H2O2和Fe2+发生Fenton 反应产生羟基自由基（OH·），OH·具有强氧化性，有催化染料脱色的能力，其催化有机物的反应，主要通过对-C-C-键发生脱氢处理或与-C=C-双键发生加成反应，促使-C=C-双键结构饱和或者-C=C-双键断裂降解为小分子物质，进而使染料分子降解脱色[2-3].另外Fenton 试剂中的Fe2+在反应中被氧化后形成的Fe3+具有絮凝生物大分子效果，对反应后的废液进行离心、过滤或自然沉淀处理，能将絮凝物沉淀下来[4].有采用次氯酸钠对G250废液进行脱色的报道[5]，尚未见使用Fenton试剂对G-250废液的褪色效果进行研究的报道.本文对该问题进行了探究，为实验室中G-250废液的处理提供参考.

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

FeSO4（AR 级）、30%H2O2（AR 级）、NaOH（AR 级）、无水乙醇（AR 级）、考马斯亮蓝G-250（AR 级）、质量分数为85%磷酸（AR级）和高铁酸钾（AR级）等药品购自国药集团.

pH 计：梅特勒公司；电子天平TP-114：丹佛仪器公司；紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限公司.

1.2 实验方法

1.2.1 考马斯亮蓝G-250废液

G-250废液是指对文献[1]考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度实验项目开展中产生的废液，经单独收集，初步测定收集的G-250废液的pH值在1.5～2之间.

1.2.2 单因素实验

在预备实验的基础上，在20 mL G-250废液的反应体系中分别考察三个单因素pH、H2O2投加量和Fe-SO4投加量，多个水平（pH=2、3、4、5、6，H2O2投加量30、40、50、60、70、80、90 μL，FeSO4投加浓度达到0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25 g/L）对G-250废液脱色率的影响.操作步骤为：室温下取G-250废液加NaOH 调节废液的pH 达到实验设计pH 值，取20 mL 的符合实验设计的不同pH 值的废液于试管中，再依次加入设计的FeSO4和H2O2达到实验设计要求（单因素实验中3个因素的基本条件为pH=3，FeSO4投加浓度为2 g/L、H2O2投加量为30 μL），震荡摇匀，室温静置30 min，6 000 r/min 离心5 min 取上清液，在595 nm处测定上清液的吸光值，分别测定脱色处理前后的吸光值，根据以下公式计算脱色率.

其中：A0为废液处理前的吸光值；A为Fenton试剂处理后溶液的吸光值.

1.2.3 响应面实验优化设计

以G-250废液的脱色率作为响应值，运用响应面优化软件（Design Expert 8.0），设计三因素三水平响应面优化实验，实验设计依据Βox-Βehnken原理，考察pH、FeSO4的投加浓度、H2O2投加量及各因素间交互作用对G-250废液脱色率的影响[6]（表1）.以+1，0，-1分别代表自变量的高、中、低水平，共进行17个处理组实验.

表1 响应面分析因素水平表Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 Fenton试剂氧化脱色G-250分子的机理

紫外-可见光光谱：用紫外-可见光分光度计对Fenton试剂处理后的G-250废液进行表征，扫描范围为200～800 nm；取Fenton 试剂处理后的废液10 mL，加入5%的高铁酸钾1 mL，混匀反应30 min 后离心收集上清液，扫描上清液200～800 nm 范围的光谱.根据不同试剂处理前后的废液的光谱变化推断Fenton试剂导致G-250色素分子脱色的可能机理.

2 结果与分析

2.1 pH值对G-250废液脱色效果的影响

结果表明pH值对G-250废液脱色率有较大影响（图1）.脱色率随着pH值的增加呈现先增加再下降的趋势，在pH=4时，脱色效果最好.可能是亚铁离子在溶液中的存在形式和溶液的pH值存在很大关系，Fenton试剂在pH在3～5的溶剂中促进反应向产生羟自由基方向进行[6]，能产生足够的羟基自由基来氧化降解G250废液，在中性和碱性环境中，亚铁离子催化H2O2产生羟基自由基的能力下降[7].后续脱色处理时，选择pH=4.

图1 pH值对Fenton 试剂脱色G-250废液的影响Fig.1 Effect of pH on decolorization of G-250 waste solution by Fenton reagent

2.2 FeSO4浓度对G-250废液脱色效果的影响

G250 废液中投加不同浓度的FeSO4对废液脱色率的影响见图2.在FeSO4浓度小于1.5 g/L 的时候随着FeSO4浓度的升高，G-250 废液脱色率逐渐增加，浓度大于1.5 g/L 脱色率反而会下降.Fe2+是Fenton 反应中的催化剂，是产生羟基自由基的必要条件[8].当Fe2+过量时会导致H2O2分解速度加快，部分OH·尚未及时与有机物结合，就进行了副反应（H2O2+Fe2+→2OH·，2OH·→H2O2），会导致脱色率降低[9]，所以合适的FeSO4投加浓度是1.2～1.7 g/L.

图2 FeSO4投加量对Fenton 试剂脱色G-250废液的影响Fig.2 Effect of FeSO4 dosage on decolorization of G-250 waste solution by Fenton reagent

2.3 H2O2的投加量对G-250废液脱色效果的影响

随着H2O2投放量的增加，G-250 废液脱色率先升高以后略微有所降低（图3）.当H2O2的投加量为60 μL时废液脱色效果最佳.当投加量大于60 μL时脱色率降低可能是过量的H2O2除可迅速氧化Fe2+成Fe3+，也会产生副反应（·HO+H2O2→HO2·+H2O2，HO2·+·HO→H2O+O2）[10]，副反应消耗·HO，使H2O2无效分解，脱色率降低.

图3 H2O2投加量对Fenton试剂脱色G-250废液的影响Fig.3 Effect of H2O2 dosage on decolorization of G-250 waste solution by Fenton reagent

2.4 考马斯亮蓝G-250废液脱色率的响应面优化实验结果

2.4.1 回归模型的建立与分析

根据单因素实验结果，分别选取三个单因素（A：pH；Β：投加的FeSO4浓度；C：H2O2投加量）的三个水平进行中心组合实验，利用响应面法优化Fenton试剂对G-250废液的脱色，设计并进行17次试验，实验设计方案及结果如表2所示，方差分析结果见表3.

表2 Βox-Βehnken 实验设计与结果Tab.2 Design and results for Βox-Βehnken test

表3 回归模型方差分析结果Tab.3 Variance analysis of regression model

利用Design-Expert 8.0 软件对表3 数据进行二次多项式回归拟合，得到回归方程：Y=95.91-2.79A+1.19Β+3.83C+1.86AΒ+3.42AC+2.61ΒC-10.95A2-6.82Β2-9.27C2，由表3 可知，模型P＜0.000 1，说明预测值与试验值存在相关性；失拟项P＞0.05，说明残差由随机误差引起；结果表明此数学模型对Fenton 试剂脱色G-250 废液效果的实际值与预测值之间具有很好的拟合度，该模型可以用于Fenton 试剂对G-250废液的脱色率的分析、预测和确定脱色效果的最佳反应条件优化[6,11].由表3 中P值大小可以看出，3 个因素中对G-250废液脱色率影响的大小顺序为：H2O2投加量＞pH值＞FeSO4投加浓度.

2.4.2 G-250废液脱色率响应面分析与优化

响应曲面是指当pH值、H2O2投加量、FeSO4投加浓度的其中一个因素取零点水平的时候，其他两个因素的交互作用对G-250 废液脱色率的影响情况（图4 至图6）.从图4 和图6 中可以看出H2O2投加量相较于pH 值、FeSO4溶液浓度的曲线陡峭，说明H2O2投加量对G-250 废液脱色率的影响最大；图4 和图6 三维图的投影即等高线呈现椭圆形，说明两因素交互作用对脱色率影响显著.响应曲面结果与回归模型方差分析结果（表3）一致.

图4 H2O2投加量与pH值交互作用的响应面Fig.4 Response surface of interaction between pH value of solution and H2O2 dosage

图5 pH值与FeSO4投加量交互作用的响应面Fig.5 Response surface of interaction between pH value of solution and the concentration of FeSO4

图6 FeSO4投加量与H2O2投加量交互作用的响应面Fig.6 Response surface of interaction between the concentration of FeSO4 and H2O2 dosage

2.4.3 最佳工艺的预测与验证

使用Design Expert 8.0的优化功能，把脱色率的目标选项设定为最大值，运行软件得到一个最优的理论方案，即：H2O2投加量为62.08 μL、FeSO4的浓度1.53 g/L、pH 值为3.91，此时的理论脱色率为96.49%.为方便实际操作：在20 mL G-250废液中，选取H2O2投加量为60 μL，FeSO4投加浓度为1.5 g/L，pH值为4，进行了五次验证试验，测得G-250废液平均脱色率为95.93%，与预测值间的相对差值为0.56%，表明用响应面法可以用于Fenton试剂对G-250废液脱色的因素水平进行优化.

2.5 Fenton试剂使G-250褪色的化学机理

Fenton 试剂脱色G-250 废液后光谱扫描结果表明在400～800 nm 的可见光区没有光吸收（图7），Fenton 试剂可以使G-250 废液脱色，在紫外光区的240 nm 处有强吸收峰，表明处理后废液中有共轭双键存在，且应该是带有苯环结构的分子[12]（图7）.Fenton试剂脱色G-250后的废液又加入高铁酸钾处理后，上清液扫描得到的光谱240 nm 处的光吸收峰消失（图7），原因可能是强氧化剂高铁酸钾能够氧化打开苯环结构，产物主要有顺丁烯二酸、反丁烯二酸、草酸和甲酸等有机小分子[13-15]，苯环结构被破坏.结合G-250 自身结构特点和可能的降解点，推测Fenton试剂产生的OH·可以攻击考马斯亮蓝G-250分子的某些共价键（图8 红色弧形箭头所指）并使其断裂，把G-250 分子降解成含苯环的游离小分子从而达到脱色目的（图8），同时Fenton 反应中产生的Fe3+能产生絮凝效果使部分染料和蛋白质结合成的大分子物质絮凝沉淀[7]，从而达到较好的脱色效果.

图7 Fenton试剂处理G-250后光谱图及高铁酸钾处理后光谱Fig.7 Spectrogram of G-250 treated with Fenton reagent and potassium ferrate

图8 Fenton试剂降解G-250分子后产物示意图Fig.8 G-250 structure diagram and its possible degradation of chemical bonds

3 结论与讨论

采用Fenton 试剂降解G-250 废液，通过单因素试验和响应面优化方法，优化了最优反应条件，确定在20 mL G250 废液体系中，H2O2投加量60 μL，FeSO4 投加浓度为1.5 g/L，pH 值为4 时G-250 废液脱色率可达到95.93%，条件优化结果可为考马斯亮蓝G-250废液的脱色提供参考依据.

Fenton 氧化法中，H2O2投加量对脱色率的影响最大，可能是Fe2+存在的情况下，H2O2投加量的多少会直接影响羟基自由基生成的有效量，FeSO4有双重作用，Fe2+可以充当催化剂提高反应效率，Fe2+被氧化后生成的Fe3+能够产生絮凝效果，可以把结合蛋白质大分子的色素分子或游离的G-250 分子通过絮凝作用沉淀下来，脱色效果好.Fenton试剂氧化能力强、可产生絮凝沉淀、脱色反应快、药剂简单、成本低，是处理实验室内G-250 废液的良好方法.但其脱色后的废液中仍然含有大量具有苯环分子结构的小分子化合物，其环境毒理效应还需要进一步探讨.