基于NIRS及HPLC的经典名方中苦杏仁炮制工艺研究

毛九州，李 帅，朱红梅，张爱军

(四川省中医药科学院，四川 成都 610041)

苦杏仁为蔷薇科植物山杏(PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim.)、西伯利亚杏 (PrunusSibiricaL.)、东北杏(PrunusmandshuricaKoehne)、杏(PrunusarmeniacaL.)的干燥成熟种子[1]，有小毒。国家中医药管理局会同相关部门于2018年4月13日发布的《古代经典名方目录(第一批)》[2]中第32首为小续命汤，目录中给出了其原方描述、出处、组成、用法制法及剂型。早在1 400余年前，小续命汤首载于孙思邈的《备急千金要方》。在漫长的临床实践中，方剂中所述的药材从基原、产地、药用部位、加工还是炮制均出现了变化，因此笔者认为应尽可能地选择与古方或者长期应用最为接近的药物，过渡至现行标准或选择与现行标准规定最为接近的药物[3-4]。经文献考证以及2020年版《中国药典》的规定，建议本研究中苦杏仁按2020年版《中国药典》的燀苦杏仁照燀法(通则 0213)去皮，用时捣碎[5]。

苦杏仁在中药方剂中广泛使用，主要用于治疗咳嗽气喘、胸满痰多、肠燥便秘等，具有降气止咳、平喘、润肠通便的作用[6]。然而，苦杏仁有些许毒性，由于苦杏仁酶可以使苦杏仁苷转变为野樱苷，野樱酶可继续水解野樱苷产生杏仁腈，最后，杏仁腈在酶的作用下可以产生苯甲醛和氢氰酸，从而导致中毒，甚至呼吸麻痹。经加热炮制后的苦杏仁，苦杏仁酶被杀死进而降低苦杏仁的毒性，杀酶保苷的作用显现出来[7]。并且，炮制苦杏仁可以在保留有效成分的前提下，除去非药用部分。因此《中国药典》2020 年版四部(通则 0213)炮制通则中规定燀法：取待炮制品投入沸水中，翻动片刻，捞出，放入冷水中，除去种皮，晒干[6]。但该法未明确写明燀制加水量、燀制时间、干燥温度和干燥时间等条件，本研究考察苦杏仁的炮制工艺参数，以期为燀苦杏仁的标准化生产提供参考依据。

近红外光谱技术(NIRS)因具有实时快速、无损、成本较低、环境污染较小等特点，已在炮制过程中得到了广泛应用。本研究将其应用NIRS技术快速对苦杏仁进行定性及定量测定，以期有利于苦杏仁炮制品的质量控制。

1 材料

1.1 仪器

液相色谱仪(安捷伦公司，美国，型号：1260型)；电子天平(梅特勒-托利多公司，瑞士，型号：XS205)；超声波清洗器(昆山市超声仪器，型号：KQ-300B)；电热鼓风恒温干燥箱(成都电烘箱厂，型号：DB-207)；药典筛(浙江上虞市华丰五金仪器有限公司，型号：2号筛)；近红外光谱仪(步琦公司，瑞士，型号：NIR Flex N-500)，石英玻璃样品池、样品旋转器漫反射积分球、数据处理软件(步琦公司，瑞士，型号：NIRcal 5.4)。

1.2 试药

苦杏仁苷(110820-201808，HPLC 88.2%，中国食品药品检定研究院)。各批药材均于当年3月份采摘，装在塑封袋中，贮存于干燥密闭条件下，具体药材信息见表1。炮制研究所用苦杏仁为(山杏PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim 购于山西省长治市平顺县)产地筛选KXR01，02，03，04，05，06共6批样品均匀取样，各取300 g，混合而成1 800 g。乙腈为色谱纯；其余试剂均为分析纯；水用怡宝纯净水。近红外扫描样品为苦杏仁优质产地原药材粉末01～15批(过2号筛)，优质产地燀苦杏仁粉末01～15批，产地筛选原药材粉末01～18批，产地筛选不同炮制方法燀苦杏仁饮片粉末01～12批，具体信息如表1。

表1 药材信息

2 方法与结果

2.1 干燥条件的选择

2.1.1 不同干燥品的制备 根据2020年版《中国药典》四部(通则 0213)炮制通则明确规定：燀法，水温为沸水[5]。本次燀制工艺的考察以苦杏仁苷含量为指标，先进行适宜干燥条件的考察，包括干燥温度和干燥时间两个因素。确定干燥条件后，再进行加水量、燀制时间两个因素对炮制品质量影响的考察。预试实验进行了5倍、7倍、10倍水量的试验，由于采用5倍水量燀制易煮干，未能达到合理的燀制时间，所以排除5倍水量，优选7倍、10倍水量因素。

本次试验拟将苦杏仁600 g采用7倍水量燀制10 min，先均分后考察不同的干燥方法[8]。结合文献[9]可知，选择40 ℃用于干燥，消耗时间过长，100 ℃干燥温度易使样品表面出现焦斑，性状不符合《中国药典》要求，故考察的干燥条件由表2所示。

每份样品至少50 g。由于苦杏仁含有杏仁油，每份样品应整粒放入烘箱，不可敲碎或粉碎后进入烘箱，避免杏仁油挥发导致误差。为使实验数据准确，将所有干燥样品分别用打粉机粉碎后再进行含量测定。

表2 考察干燥条件 (n=2)

2.1.2 炮制品的制备 生苦杏仁：取原药材，除去杂质、残留的核壳及褐色油粒；燀苦杏仁：取净苦杏仁50 g，置下表所示水量的沸水中，加热煮时间如表3所示，至苦杏仁膨胀，种皮易脱落时，捞出，置冷水稍浸，立即取出，搓去种皮，筛去种皮[10]。干燥方法采用“2.1.1”项下选出的方法。

表3 考察燀制条件 (n=3)

每份样品至少50 g。采用“2.1.1”选出的干燥条件进行烘干，样品粉碎称量进行含量测定。

2.2 苦杏仁各干燥品、炮制品的苦杏仁苷含量比较

2.2.1 色谱条件 Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL；紫外检测波长207 nm；以乙腈-0.1%磷酸溶液(8∶92)为流动相等度洗脱。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取对照品，用甲醇溶解为44.17 μg/mL的对照品溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取各干燥条件的样品粉末(过二号筛)约0.25 g，精密称定，置于具塞锥形瓶，精密加入甲醇25 mL，密塞，称重，超声(功率250 W，频率50 kHz)30 min，冷却后补重，摇匀，过滤，精密量取续滤液5 mL于50 mL量瓶中，加50%甲醇定容，摇匀，取续滤液过0.45 μm滤膜。

2.2.4 含量测定结果 供试品溶液10 μL注入HPLC，色谱如图1所示，根据峰面积计算苦杏仁苷含量，含量以3次测得的平均值计，结果见表4、表5。根据结果确定燀制工艺后，将优质产地药材统一按燀制工艺进行炮制后，测定其苦杏仁苷含量，结果见表6。

表4 干燥品含量测定结果 (n=2)

表5 炮制品含量测定结果 (n=3)

表6 原药材及炮制品含量测定结果 (n=3)

2.3 苦杏仁炮制品的过氧化值比较

2.3.1 试验条件 苦杏仁各炮制品的过氧化值根据2020年版《中国药典》四部(通则2303)酸败度测定法进行试验。正己烷、三氯甲烷、冰醋酸等试剂均为分析纯、新制碘化钾饱和溶液、硫代硫酸钠滴定液等按要求配制。

2.3.2 油脂提取 取样品30 g(初粉)，置索氏提取器中，加正己烷120 mL后水浴加热回流2 h，放冷，用3号垂熔玻璃漏斗滤过，滤液减压回收溶剂至尽，残留物为油脂。

2.3.3 过氧化值测定 取油脂2 g，精密称定，置250 mL的干燥碘瓶中，加三氯甲烷-冰醋酸(1∶1)混合溶液30 mL溶解。精密加入新制碘化钾饱和溶液1 mL密塞，轻轻振摇半分钟，在暗处放置3 min，加水100 mL，用硫代硫酸钠滴定液(0.01 mol/L)滴定至其呈浅黄色时，加淀粉指示液1 mL，继续滴定至蓝色消失；同时做空白试验，照公式计算。

2.3.4 过氧化值结果 苦杏仁各炮制品的过氧化值结果如表7。

表7 炮制品过氧化值结果 (n=2)

2.4 燀制工艺小结

由表4结果可知，经过80 ℃、2 h干燥的样品，其苦杏仁苷平均含量在样品中最高，结合所需干燥时间和节约热能的考虑，确定燀苦杏仁样品的干燥条件为80 ℃下放置2 h。

预试验曾通过单因素试验对燀制水量进行初步筛选，5倍量水量较少，即使加热时间为最短的5 min，仍有烧干的风险，后续试验的水平为7倍水量及10倍水量。由表5结果可知，在同样水量燀制的条件下，燀制10 min含量最高。所以燀制时间选用10 min，用水量需结合实际实验以及节约水资源的考虑，7倍量水已足够用于苦杏仁的燀制，7倍量水燀制10 min与10倍量水燀制10 min的含量相差0.11%，结合过氧化值的数据(表7)分析，7倍量水燀制10 min样品的过氧化值最小，所以燀制方法选择7倍量水燀制10 min。优质产地药材同样进行炮制，含量测定结果如表6。

臧彬如等[8]通过实验，优选燀苦杏仁的工艺是加水量10倍，煮沸10 min，搓去皮，在电热鼓风干燥箱60 ℃条件下，干燥6 h。种振等取净苦杏仁，加入12倍的沸水中，燀制5 min，取出，置于冷水中浸制3 min，搓去种皮，置于70 ℃烘箱中，干燥，即可[11]。上述文献研究所得工艺各不相同，本研究以燀苦杏仁的指标性成分苦杏仁苷含量、过氧化值等多指标代替单一指标来优选燀苦杏仁炮制工艺，所用水量较少，更适合工厂规模化生产。结合近红外光谱技术，可在炮制过程中进行质量控制，一定程度上为燀苦杏仁的工业化生产提供参考。

2.5 近红外研究

2.5.1 近红外光谱的采集 取适量样品粉末，置于平坦干净的培养皿中，并使之均匀分布于皿底部。以仪器内置背景为参比，用NIR FLEX N-500型近红外光谱仪进行扫描，采用积分球附件测量，分辨率8 cm-1；扫描范围：4 000～10 000 cm-1，扫描次数8次，每个样品重复装样扫描3次。光谱数据取 3 次采样的平均值。

2.5.2 光谱直观比较 优质产地苦杏仁原药材粉末、产地筛选苦杏仁原药材粉末、优质产地燀苦杏仁饮片粉末、产地筛选不同炮制方法燀苦杏仁饮片粉末共68批次的近红外原始光谱见图2，相同种类不同来源或批次的样品，原始光谱基本一致。

2.5.3 光谱预处理及结果 为避免样品中含有的无关因素干扰近红外光谱，需对光谱进行预处理。NIRS法建模时常用的预处理方法有标准正则变换(SNV)、一阶导数(db1)、标准化(ncl)、多元散射校正(mf)等[12]。

本实验在NIRcal 5.4数据处理软件中导入68批已采集好的198条光谱，按照6∶3的比例对样品分为定标集(C-set)和验证集(V-set)。采用 NIR Flex N-500 型近红外光谱仪所带的 NIRcal 5.4 数据处理软件进行自动建模，系统自动对选中光谱进行标准化处理和微分计算，选取不同波段比例、不同波段范围、不同前处理方法对原始的NIRS图进行处理，旨在有效消除基线飘移，更全面地反映不同样品之间的信息差异，根据综合评价指标(Q值)选出最优模型，预处理结果见表8。

选用采用Clustar 方法进行建模，选择将数据进行无量纲的转化到0-1*后进行Between 0 and 1*，1st BCAP(n01，db1)的前处理方法对光谱进行前处理，由表8可知，最佳建模结果为选取5 000～10 000cm-1波段的图谱，最终处理效果如图3。

注：样品编号1：DKXR01-15；编号2：KXR01-15；编号3：KXR01-15；编号4：DKXR01-06。

表8 预处理结果

2.5.4 定性模型的建立 按照83%的波段比例对，5 000～10 000cm-1的波段，通过NIR，采用聚类分析方法，可将DKXR与KXR进行区分。图4中的横坐标表示主成分l(PC1)的得分值，纵坐标表示主成分2(PC2)的得分值[12]，DKXR与KXR样品明显地聚类为互相独立的2组。由图4、图5可知，此模型可以较好地将DKXR与KXR样品分开，通过NIR可以将DKXR和KXR较好地进行区分。

图3 预处理光谱

图4 苦杏仁与燀苦杏仁的主成分二维得分图

图5 苦杏仁与燀苦杏仁的主成分三维图

2.5.5 NIRS定性模型的验证 对建立的模型进行验证，以属性距离和光谱残差来表示模型验证过程中光谱判别的依据[13]，DKXR所允许的最大距离为0.057 580；最大允许残差为0.000 523；KXR所允许的最大距离为0.013 076，最大允许残差0.000 523。在该模型中所有验证集和校正集光谱均被正确判断，准确率100%。

2.5.6 DKXR、KXR部分样品建立定性模型 为苦杏仁和燀苦杏仁使用定性模型区分，将4类样品，分为建模组和外部验证组，如表9所示。原始光谱如图6所示。

表9 分组情况

预处理方式同上文，采用 NIR Flex N-500 型近红外光谱仪自带的 NIRcal 5.4数据处理软件进行自动建模，根据Q值判断处理结果，Q值越大效果越好。

由表10可知，最佳建模结果为选取83%波段比例、5 000～7 144；7 404～10 000 cm-1波段的图谱，采用n01，db1的前处理方法对光谱进行前处理，处理效果如图7。

图6 近红外光谱叠加图

按照79%的波段比例对5 000～7 144；7 404～10 000 cm-1的波段，通过NIR，采用聚类分析方法，可将DKXR与KXR进行区分。由图8可知，此模型可以较好地将DKXR与KXR样品分开，DKXR与KXR可以较好地分离。将54批样品用于建模，按照6∶3的比例划分样品的定标集(C-SET)和验证集(V-SET)，由结果可知KXR最大距离：0.000 030，最大允许残差：0.005 049，DKXR最大距离：0.042 086，最大允许残差：0.005 049。外部验证结果为6批DKXR样品均能准确验证，准确率为100%。内部验证结果为验证和校正集均被准确判断，准确率为100%。由实验结果说明DKXR，KXR部分样品也可建立定性模型，模型准确率较高。

表10 预处理结果

2.5.7 定量模型的建立 校正集和验证集样品的选择是从采集光谱的68批样品中，结合高效液相色谱法(HPLC)测定苦杏仁药材及炮制品的苦杏仁苷含量作为其化学真值，建立起定量分析模型。选取45个有代表性的样品组成校正集，剩余23个样品为验证集，验证集样品的含量在校正集含量范围内，用于近红外模型的建立。图10为68批KXR及DKXR近红外光谱叠加图。

图7 预处理光谱

图8 苦杏仁与燀苦杏仁的主成分二维得分图

预处理方式同上文，采用 NIR Flex N-500 型近红外光谱仪自带的 NIRcal 5.4 数据处理软件进行自动建模，根据Q值判断处理结果，如表11所示。

由表11可知，最佳建模结果为选取83%波段比例、5 000～10 000 cm-1波段的图谱，采用SNV、db1的前处理方法对光谱进行前处理，处理效果如图11。

图9 苦杏仁与燀苦杏仁的主成分三维图

图10 68批KXR及DKXR近红外光谱叠加图

表11 预处理结果

由结果可知，校正集和验证集相关系数(R2)分别为0.937 2 和0.922 2，校正集和验证集公式分别为f(x)=0.937 2x+0.392 9，f(x)=1.030 7x-0.999 9，表明该方法简便准确，快速可靠。模型具体参数见图12。

3 讨论

目前关于近红外光谱技术在苦杏仁粉末的定性鉴别和定量测定的应用相关文献报道较少，且仅有报道的文献只研究了基于近红外高光谱成像技术对不同产地苦杏仁和桃仁药材的定性鉴别[14]及中药液体制剂提取过程的近红外定量测定苦杏仁苷[15]，采用近红外光谱技术对苦杏仁炮制品进行测定相关方面，笔者未见国内外文献报道。中药材成分繁多，传统评价方法是高效液相色谱法、气相色谱法等，但这些常规分析方法耗时耗力，成本较高，属于事后检验。近红外光谱法测定法可初步应用于苦杏仁药材及饮片质量的快速评价。

本研究仍存在一些不足之处，采用的样本量不够大，需采集更多产地的苦杏仁药材及饮片光谱补充到定量模型中，提高定量模型的准确性和稳定性。

图11 预处理光谱

图12 苦杏仁中苦杏仁苷的测量值与预测值相关性

本研究通过文献及实验对经典名方中的燀苦杏仁炮制工艺及干燥条件进行了研究，基于NIRS、HPLC优选出了燀苦杏仁最佳炮制工艺，初步建立了对于苦杏仁炮制品的近红外定性及定量模型，对保证燀苦杏仁饮片的质量具有一定的意义。