同属不同种桑叶总黄酮的含量测定及分析

黄晓彤，史 锐，刘苗苗，丛龙娇，刘斯文，王琪瑶

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 沈阳 110000)

桑叶是桑科植物桑(MorusalbaL.)的叶子，我国约有11种桑叶，分布于全国大部分地区，以长江流域尤其江浙一带为多[1]。桑叶具有降血脂[2]、抗氧化[3]、降血糖[4-5]、抗炎[6]等功效，在医药、保健品等领域的开发价值及利用价值较高[7]，近年来被广泛用于生产代用茶[8]、焙烤制品[9]等产品中。桑叶中活性成分和营养物质极其丰富，例如萜类化合物[10]、黄酮[11]、多酚[12]等。黄酮类成分是桑叶药材发挥药效作用的最主要成分，现行《中国药典》将芦丁这一黄酮苷类成分作为桑叶药材含量测定的指标性成分。桑叶在实际应用中存在品种混淆的问题，导致入药品种不明确。通过查阅古代本草发现，古人对不同品种桑叶进行过研究且得出“鸡桑最堪入药”的结论，但目前中国药典中仅收录一种桑叶，且未明确品种，所以对桑属不同种桑叶进行含量测定相关研究对桑叶资源的开发利用具有十分重要的意义。因此，本研究对同属不同种桑叶中总黄酮含量进行测定，并采用SPSS 26.0软件对其进行主成分分析，为桑叶药材质量的评价提供实验依据，对后续优化桑叶提取工艺具有深远意义。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

药材：桑叶分别采集于江苏镇江、新疆和田以及在中检所购买的桑叶对照药材，以上样品由辽宁中医药大学康廷国教授鉴定为桑科桑属桑树的叶子，样品序号、来源、采集时间等，详见表1。

试剂：无水乙醇(沈阳市新化试剂厂)；HPD100大孔吸附树脂(东鸿化工有限公司)；蒸馏水(娃哈哈集团有限公司)；氢氧化钠(天津大茂试剂厂)；芦丁标准品(成都格利普生物科技有限公司，批号：T27F10Z81699)；硝酸铝(天津大茂试剂厂)；亚硝酸钠(天津大茂试剂厂)。

表1 桑叶的样品来源

1.2 仪器与设备

UV5100紫外可见-分光光度计(安徽皖仪科技股份有限公司)；FW100高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器设备有限公司)；中药筛子(绍兴市上虞英华贸易有限公司)；KQ5200DB型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法

2.1 桑叶总黄酮含量测定方法

2.1.1 标准品溶液的制备 取5.18 mg芦丁标准品，精密称定，放置于25 mL容量瓶，用70%的乙醇溶液定容至刻度，充分摇匀，即得到0.207 2 mg/mL质量浓度的芦丁标准溶液，将标准溶液于4 ℃冰箱中贮存备用。

2.1.2 供试品溶液的制备 取桑叶粉末2 g，精密称定，加30 mL石油醚(60～90 ℃)，加热回流30 min，弃去石油醚液，药渣挥干，向体系中加入30 mL乙醇，超声处理20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加热水10 mL，置60 ℃水浴上搅拌使溶解，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇使其充分溶解，作为供试品溶液。

2.1.3 线性关系考察 取上述标准品溶液6份，每份分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，精密称取后放置于25 mL容量瓶，向体系中加入1.0 mL 5%的NaNO2，充分混匀后放置6 min左右；精密量取1.0 mL的10%Al(NO3)3加入体系中，充分摇匀后静置6 min；向体系中加入4%的NaOH 10.0 mL，加入70%的乙醇溶液适量，定容至刻度线，摇匀静置15 min。得到浓度为1.66 μg/mL、3.32 μg/mL、4.97 μg/mL、6.64 μg/mL、8.30 μg/mL的标准品溶液。以70%的乙醇溶液作为空白对照溶液，测定其在510 nm处的吸光度值。以芦丁标准品质量浓度(mg/mL)为X轴，Y轴为吸光度(A)绘制标准曲线，并求出线性回归方程。

2.2 桑叶样品总黄酮含量的测定

准确称取桑叶13份，每份1.00 g，分别制备13份供试品溶液，向体系中加入1.0 mL5%的NaNO2，充分混匀，静置6 min左右；加入1.0 mL的10%Al(NO3)3，充分摇匀，放置6 min；向体系中加入4%的NaOH 10.0 mL，加入70%的乙醇，并定容到刻度线，摇匀后放置15 min。同时空白对照溶液选择70%的乙醇，进行基准校正后，用紫外可见分光光度计测定510 nm处的吸光度值。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度考察 精密称取桑叶药材(样品3，鲁桑)1.0 g，量取0.4 mL溶液，按“2.2”项下方法制备样品，同时空白对照溶液选择70%的乙醇，于510 nm波长处测定吸光度值A，平行测定6次，计算RSD值。

2.3.2 稳定性考察 精密称取桑叶药材(样品3，鲁桑)1.0 g，量取0.4 mL溶液，按“2.2”项下方法制备样品，同时空白对照溶液选择70%的乙醇，依次在 0、0.5、1、2、4、6、12、24 h 时，于510 nm波长处测定吸光度值A，计算RSD值。

2.3.3 重复性考察 精密称取桑叶药材(样品3，鲁桑)1.0 g，6份，量取0.4 mL溶液，按“2.2”项下方法制备样品，同时以70% 的乙醇作为空白对照，于510 nm波长处分别测定6份样品的吸光度值A，计算RSD值。

2.3.4 加样回收率考察 量取已知含量的药材粉末(样品3，鲁桑)1.0 g，精密称定，按照 0.8∶1，1∶1，1∶1.5 比例加入芦丁对照品，各平行测定3份，一共9份样品，按“2.2”项下方法分别制备9份供试品溶液，同时以70% 的乙醇作为空白对照，于510 nm波长处分别测定6份样品的吸光度值A，计算RSD值。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

标准曲线如图1所示，以芦丁标准溶液的质量浓度(mg/mL)为X轴，吸光度(A)为Y轴，绘制标准曲线为y=0.076 1x+0.070 4(R2=0.999 3)。由结果可知其在1.66 μg/mL～8.30 μg/mL范围内线性关系良好。

3.2 方法学考察结果

3.2.1 精密度考察 精密度考察结果见表2，6次吸光度的RSD值为1.19%，表明仪器精密度良好。

图1 芦丁标准曲线

表2 精密度测定结果

3.2.2 稳定性考察 稳定性考察结果见表3，0～24 h内测定的吸光度的RSD值为 1.12%，说明桑叶药材总黄酮提取物在24 h内较稳定。

3.2.3 重复性考察 重复性考察见表4，6个样品吸光度的RSD值为1.41%，说明该方法重复性较好。

表3 稳定性测定结果

表4 重复性测定结果

3.2.4 加样回收率考察 加样回收率考察结果见表5，按比例依次得到加样回收率平均值为99.08%、99.28%、99.94%，RSD值分别为 0.43%、1.06%、0.30%，说明该方法准确度良好。

3.3 不同桑种桑叶中总黄酮含量测定结果

精密称取13份桑叶粉末，每份1.00 g，制备供试品溶液，采用“2.1”项下方法测定不同种样品总黄酮含量，不同种间总黄酮含量存在差异性，结果见图2。

图2 同属不同种桑叶总黄酮含量比较

表5 加样回收率考察结果

含量测定结果显示，华桑中总黄酮含量最高为23.18 mg/g，其次是鸡桑21.45 mg/g、山桑19.05 mg/g、蒙桑20.35 mg/g等。

3.4 桑属不同桑种桑叶的综合质量研究

本实验以测量的总黄酮含量为原始数据应用SPSS 26.0软件对其进行主成分分析，计算相关矩阵的特征值及其方差贡献率(表6)，以特征值(VIP)>0.5 为提取标准，得到前两个主成分的累计方差贡献率为 84.776%(>80%)，同时碎石图(图3)也清晰呈现出各主成分所代表信息的走势情况，说明前2个主成分反映了桑叶药材中84.776%的信息量。

总黄酮成分得分系数矩阵显示，成分1为0.243、成分2为0.920。为了综合评价以黄酮为变量的桑叶药材整体质量，根据成分得分矩阵对各主成分的载荷值进行计算，并根据其综合得分的高低对不同种桑叶的质量进行排序，结果见表7，鸡桑综合排名第一。

表6 主成分信息和方差贡献率

图3 碎石图

表7 综合得分排名

4 讨论

桑叶主要以辅助降压及辅助降血脂为主要作用，桑叶黄酮可促进胆固醇含量的增加，从而改善高脂血症大鼠模型SOD的活性，抑制丙二醛MDA的生成[13]。近年来相关研究得出，黄酮和多糖所具有的抗氧化、清除自由基作用，可修复或保持胰岛素β细胞的生理功能，促进膜岛素分泌，降低血糖。Hunyadi A等[14]发现异槲皮苷、芦丁和绿原酸能有效降低2型糖尿病大鼠模型血糖。因此，黄酮中主要药效成分含量的多少对临床应用具有一定的影响，故选取总黄酮为指标成分进行统计学分析，本研究对同属不同种桑叶进行了总黄酮含量的测定，为鉴别不同种桑叶提供方法学基础，为确保临床精准用药提供实验依据。

本实验选择总黄酮的测量结果为原始数据对其进行分析，提取出的主成分方差贡献率为84.776%(>80%)，是造成种间差异的主要成分。因此根据得分系数对每个样品的总得分进行计算，对不同种桑叶进行综合排名。实验结果显示，鸡桑综合排名第一，与本草考证中“鸡桑，最堪入用”的理论相互验证。在此基础上，有待进行药理学研究对此理论进一步佐证。