药用和茶饮绞股蓝中总黄酮及多糖含量分析

卢泽雨，吴芳蕾，韦晓敏，温秀萍*，于虹敏，林青青，杨成梓，林 羽，2

(1.福建中医药大学 药学院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州 350122)

绞股蓝为葫芦科绞股蓝属多年生攀援草本植物绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的全草，别名七叶胆、小苦药、公罗锅底等，生长于山坡林地、路旁灌丛中，主要分布于陕西南部和长江以南各地[1]。性寒,味苦，具有清热解毒、止咳祛痰之功效。在 《救荒本草》一书中，绞股蓝被广泛用作蔬菜和食品[2]。明代医药学家李时珍在《本草纲目》中有关绞股蓝的功效记载为“治疮疖，虫咬，凉血解毒，利小便”[3]。绞股蓝中含有皂苷、黄酮、多糖、氨基酸以及无机元素等多种成分[4-8]。现代药理研究表明，绞股蓝具有多种药理活性，如降血糖血脂、抗肿瘤、免疫调节、保护肝脏及心血管、抗氧化等[9-15]。因此，绞股蓝也被全国各地茶叶加工企业成功制成绞股蓝茶等保健品销往市场，是一味药茶兼用的常用中药[16]。

目前关于绞股蓝化学成分的研究多停留于其最主要有效成分皂苷上，而对药用和茶饮绞股蓝的总黄酮和多糖类成分研究较少。本文以药用和茶饮绞股蓝作为研究对象，优化绞股蓝总黄酮的提取方法，测定不同产地绞股蓝的总黄酮和多糖含量，把握绞股蓝的市场现状，以期为绞股蓝的临床安全有效用药和质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

绞股蓝样品收集自各产地及药材市场共14批次药用绞股蓝和17批次茶饮绞股蓝(表1)，经福建中医药大学药学院杨成梓教授鉴定为葫芦科绞股蓝属植物绞股蓝Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino。

1.2 试剂与仪器

试剂：D-无水葡萄糖(526H021，北京索莱宝科技有限公司)、芦丁(B20771，上海源叶生物科技有限公司)；无水乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝，氢氧化钠，蒽酮，浓硫酸，均为分析纯，国药集团化学制剂试剂有限公司生产。

仪器：UV-9000型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)，XM7D-8222型电热恒温干燥箱(上海精宏实验仪器厂有限公司)，KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，SHB-III型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，DK-S24型电热恒温水浴锅(上海森信实验仪器有限公司)。

表1 绞股蓝样品信息

1.3 实验方法

1.3.1 波长选择 精密吸取一定量的待测样品溶液、芦丁标准溶液，加蒸馏水至10 mL，再加1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，再滴加10%硝酸铝溶液1 mL，轻轻振摇，静置6 min，最后加入10 mL的4%氢氧化钠溶液，并加蒸馏水至刻度，摇匀，静置15 min，显色后于紫外分光光度计在400～700 nm范围内进行全波长扫描，扫描结果确定绞股蓝中总黄酮最大吸收波长为510 nm。

精密吸取D-无水葡萄糖标准溶液30 mL，置于100 mL量瓶中定容，为标准品母液。再各取1 mL标准品母液于具塞试管中，冰水浴中分别加入4 mL蒽酮-硫酸溶液(4 ℃冷藏)，加完后置于沸水中煮沸10 min(自水重新沸起)，立即冷却至室温，显色后于紫外分光光度计在400～700 nm范围内进行全波长扫描，确定绞股蓝中多糖最大吸收波长为620 nm。

1.3.2 标准曲线绘制 精密称定芦丁对照品0.100 g置于100 mL量瓶中，加60%乙醇置于水浴锅中，加热溶解，再加乙醇定容，摇匀，即得芦丁对照品母液(芦丁含量为1 mg/mL)。精密吸取芦丁对照品母液各0.5 mL、1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL、4.5 mL、5.5 mL于25 mL容量瓶中，加蒸馏水至10 mL，再加1 mL 5%亚硝酸钠溶液，摇匀，静置6 min，再滴加10%硝酸铝溶液1 mL，轻轻振摇，静置6 min，最后加入10 mL的4%氢氧化钠溶液，并加蒸馏水定容至刻度，摇匀，静置15 min显色，以只加显色剂溶液作为空白对照，在510 nm波长处测定吸光度值A[17-18]。以芦丁对照品浓度(mg/mL)为横坐标X，吸光度A为纵坐标Y，绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=10.781X+0.047 1(R2=0.999 8)，由此可知其在0.02～0.22 mg/mL范围内线性关系良好。

精密吸取10、20、30、40、50 mL D-无水葡萄糖对照品溶液，100 mL量瓶中定容。冰水浴中分别加入4 mL蒽酮-硫酸溶液(4 ℃冷藏)，加完后置于沸水中煮沸10 min(自水重新沸起)，立即冷却至室温，以相应空白试剂作为对照，在620 nm处测定吸光度值。以D-无水葡萄糖对照品浓度(mg/mL)为横坐标X，吸光度A为纵坐标Y，绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=3.195X+0.112(R2=0.994 8)。该方程表明，当浓度在0.02～0.10 mg/mL时，其与吸光度线性关系良好。

1.3.3 总黄酮含量测定 样品粉碎过三号筛，干燥，称取5 g，置于锥形瓶中，加入65%乙醇65 mL，超声90 min，抽滤，滤渣回收，提取4次。将滤液合并浓缩，定容于100 mL量瓶中，摇匀，得总黄酮供试品溶液。精密吸取2 mL总黄酮供试品溶液，放置于25 mL棕色容量瓶中，加蒸馏水至10 mL，按照“1.3.2”项下方法显色。以相应空白试剂作为对照，在510 nm波长处测定吸光度值并根据标准曲线回归方程计算其总黄酮含量[17-18]。

1.3.4 总多糖含量测定 称定干燥后的绞股蓝样品粉末约1 g，包装好后置于索氏提取器内，加入适量95%乙醇，多次虹吸至样品提取液近乎透明，将药渣小心取出并干燥，再采用水加热回流提取2次，每次1 h。合并两次滤液后，将滤液浓缩到100 mL，加入乙醇，使醇含量达到80%，存放于4 ℃冰箱中静置12 h。过滤，用水溶解沉淀，溶液全部转移至100 mL量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，即得多糖供试品溶液。精密吸取1 mL多糖供试品溶液，置于试管中，按照“1.3.2”项下多糖方法显色。以相应空白试剂作为对照，在620 nm波长处测定吸光度值，根据标准曲线回归方程计算其多糖含量[19-21]。

1.3.5 单因素试验 分别设置不同乙醇体积分数、液料比、不同提取时间、不同提取次数，探究其对绞股蓝总黄酮得率的影响。

1.3.6 正交试验 以单因素实验研究结果作为主要参考依据，选择提取时间、乙醇体积分数、提取次数、料液比为考察研究对象，提取得到的总黄酮含量为考察指标，设计L9(34)正交实验方案，称取9份绞股蓝干燥粉末，每份约5 g，进行提取分析。

1.3.7 总黄酮含量方法学考察 精密度考察。精密吸取“1号”供试品溶液2 mL，根据“1.3.3”项下方法操作测定吸光度，于同一环境下连续测定6次，测定A值，计算总黄酮提取量分别为1.410、1.441、1.433、1.423、1.443、1.435 mg/g，RSD为0.9%，说明实验仪器精密度良好。

稳定性考察。精密称取“1号”样品提取液2 mL，根据“1.3.3”项下方法操作，于10、20、30、40、50、60 min分别测定吸光度，计算总黄酮提取量分别为1.443、1.440、1.435、1.431、1.421、1.410 mg/g，RSD值为0.9%，实验显色60 min内稳定性良好。

重现性考察。精密称取“1号”样品粉末6份，每份5 g，根据“1.3.3”项下方法进行操作，测定A值，计算总黄酮提取量分别为32.8842、31.934 1、31.824 8、32.451 2、32.211 5、32.058 7 mg/g，总黄酮平均提取量为32.227 4 mg/g，RSD值1.3%，说明实验方法重复性较好。

加样回收考察。精密称取6份已知总黄酮含量的“1号”样品0.2 g，均加入一定的芦丁对照品。根据“1.3.3”项下方法并提取、显色测定其吸光度值，按比例得到回收率为98.14%、101.04%、97.10%、97.50%、99.86%、99.68%，平均回收率为98.89%，RSD值为1.6%。说明该方法具有较好的准确性，可以作为绞股蓝总黄酮含量的测定方法。

1.3.8 总多糖含量方法学考察 精密度考察。精密吸取同一份 D-无水葡萄糖对照品溶液，按照“1.3.3”项下方法操作，在同一条件下连续测定6次吸光度，分别为0.289、0.299、0.292、0.305、0.294、0.295，RSD为1.91%，表明该方法精密度良好。

稳定性考察。取绞股蓝药材样品(1号)，按照“1.3.4”项下方法操作，于30、60、90、120、150 min分别测定吸光度，A值分别为0.385、0.396、0.377、0.390、0.387、0.381，RSD为1.73%，表明绞股蓝多糖溶液在150 min内稳定性良好。

重现性考察。取同一批绞股蓝药材样品(1号)6份，按照“1.3.4”项下方法操作，在同一条件下分别测定吸光度，A值分别为0.388、0.381、0.371、0.387、0.390、0.377，RSD为1.93%，表明该方法重复性良好。

加样回收率考察。取已知含量的绞股蓝药材样品(1号)6份，按照“1.3.4”项下方法操作，在同一条件下分别测定吸光度，计算回收率分别为98.95%、100.80%、99.44%、99.30%、99.05%、100.04%，平均回收率为99.60%，RSD为0.71%，表明该方法准确度良好。

1.4 数据分析

采用Microsoft Excel 2010和Graphpad Prism软件对数据进行统计分析和制图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

用超声波提取方法对总黄酮类化合物成分进行了提取，借助于乙醇能够溶解黄酮类化合物的特性，故将提取溶剂确定为乙醇，在此基础上，进一步选择不同乙醇体积分数[40%、50%、60%、70%、80%、90%(乙醇-蒸馏水)]、不同料液比[1∶11、1∶12、1∶13、1∶14、1∶15(g/mL)]、不同提取时间(30、60、90、120、150 min)、不同提取次数(1、2、3、4次)4种影响因素对绞股蓝总黄酮含量进行单因素考察。各因素分析结果表明，总黄酮含量分别在60%乙醇、提取时间90 min、提取次数3次、料液比1∶14(g/mL)时达到最大。

2.2 正交试验选取最优提取方法

在单因数试验结果基础上进行4因素3水平L9(34)正交试验，其中提取时间70、90、110 min，乙醇体积分数55%、60%、65%，提取次数2、3、4次，料液比1∶13、1∶14、1∶15(g/mL)，其余处理与“2.2.3”项下方法操作相同，提取显色在510 nm测定A值。正交试验结果得出最佳提取方法为提取时间90 min、65%乙醇体积分数、提取次数3次、料液比1∶13。最佳提取方法进行验证实验，平行测定3次，结果RSD值为1.25%，说明该方法真实，故确定用此最优提取方法对31批次绞股蓝样品的总黄酮含量进行测定。

2.3 不同产地绞股蓝总黄酮含量分析

根据供试绞股蓝总黄酮含量测定结果，不同产地31批次绞股蓝样品中，总黄酮含量均值为3.62%。绞股蓝不同用途之间的总黄酮含量无显著性差异(表2)。陕西的样品无论是药用还是茶饮绞股蓝的总黄酮含量均高于其他产地的样品；此外，广西、吉林和云南的总黄酮含量较高，而安徽的含量较低，见图1。14批次药用绞股蓝样品中，总黄酮含量范围为2.78%～4.17%，陕西、广西和云南样品的总黄酮含量较高，而四川、安徽和福建样品的含量较低；17批次茶饮绞股蓝样品中，总黄酮含量范围为2.51%～5.01%，总黄酮含量均值大于4.0%，从高到低分别来源于陕西、广西、吉林和云南，且安徽样品的总黄酮含量均值最低，为2.76%。

表2 药用和茶饮绞股蓝总黄酮、多糖含量比较

图1 不同产地绞股蓝的总黄酮含量

2.4 不同产地绞股蓝多糖含量分析

根据供试绞股蓝多糖含量测定结果，不同产地31批次绞股蓝样品中，多糖含量均值为3.43%。绞股蓝不同用途之间的多糖含量无显著性差异(表4)。陕西的样品无论是药用还是茶饮绞股蓝的多糖含量均高于其他产地的样品；湖南、安徽、云南和吉林样品中多糖含量较高，而广西、江西的含量较低，见图2。14批次药用绞股蓝样品中，多糖含量范围在2.78%～4.19%，陕西样品的多糖含量均值最高、为4.09%，湖南、安徽、云南和河北样品的多糖含量较高，而广西、福建、河南和四川样品的含量较低；17批次茶饮绞股蓝样品中，多糖含量范围在2.97%～4.27%，均值从高到低分别来源于陕西、河南、安徽、云南和吉林,其样品的多糖含量均值较高，而福建、甘肃、广西和江西样品的多糖含量均值较低。

图2 不同产地绞股蓝的多糖含量

3 讨论

3.1 绞股蓝总黄酮和多糖含量分析

31批样品的总黄酮含量在2.51%～5.01%之间，多糖含量在2.78%～4.27%之间。不同产地之间的含量差异可能与产地之间的环境气候不同有关，无论是茶饮还是药用，安徽产地的绞股蓝总黄酮含量均较低，而陕西、云南和广西的含量均较高；多糖含量方面，陕西的含量较高，而广西的含量较低。故从总黄酮和多糖的含量来看，陕西产地的质量略好于其他产地，安徽次之。

药用绞股蓝总黄酮含量平均为3.52%，茶饮平均为3.71%，可见茶饮绞股蓝的总黄酮含量略高于药用品；药用绞股蓝多糖平均含量3.41%，茶饮为3.45%，茶饮略高于药用。但对茶用、药用绞股蓝总黄酮含量和多糖含量分别进行方差分析(表2)，药用和茶饮绞股蓝样品中总黄酮、多糖含量差异均不显著(P>0.05)。故茶饮和药用绞股蓝之间品质无明显差别。

3.2 总黄酮提取工艺优化

黄酮和多糖均属于绞股蓝中的有效成分。黄酮类化合物易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，查阅文献可知常见提取试剂即为甲醇、乙醇，而水提法易混入大量杂质，导致检测结果不准确[17，22]，因此本实验采用乙醇作为提取溶剂。总黄酮提取方法较多，通过预实验比较了回流法、索氏提取法、超声提取法等，结果表明3种方法提取效率均较高，但考虑到超声提取法操作简便、耗时相对较短、提取效率高、提取温度低等优点，采用超声提取绞股蓝中总黄酮[23]。

优化的绞股蓝总黄酮的最佳提取工艺为提取时间90 min、乙醇体积分数65%、提取次数4次、料液比1∶13。该方法操作简便、提取完全，工艺可行可靠，适用于绞股蓝中总黄酮含量测定。本次实验测定了31批绞股蓝的总黄酮和多糖含量，发现不同用途绞股蓝的总黄酮和多糖含量略有差异，但无统计学意义，说明药用和茶用的绞股蓝品质相当。不同产地绞股蓝的总黄酮和多糖含量有一定差异，陕西产绞股蓝的总黄酮和多糖含量略高于其他产地，分析可能与药材种植及加工处理方式、产地自然条件等因素有关。后续可对其进行深入研究，为制定药用和茶饮绞股蓝的质量标准提供参考。