超声辅助纤维素酶法制备蔗叶膳食纤维及其理化特性分析

周永升， 莫小群， 张文婷， 龙勇益， 苏 龙， 柳富杰*

（1.广西科技师范学院 食品与生化工程学院，广西 来宾 546199；2.广西科技师范学院 广西现代蔗糖业发展研究院，广西 来宾 546199）

根据膳食纤维在水中溶解性质的不同可分为水溶性膳食纤维（SDF）和不溶性膳食纤维（IDF）（扈晓杰等，2011）。膳食纤维作为人体所需的第七营养素，其对人体有重要的生理作用。因为膳食纤维不能被小肠消化吸收，对于肠道的蠕动和吸收其他食物有着良好的促进作用，并且在食用含膳食纤维的食物后，由于其在人体胃中的逗留时间长，可以延长胃的排空时间，从而减缓对于糖类的吸收、增加饱腹感，这对于糖尿病和减肥都有良好的作用（郑文新等，2017）。有研究表明膳食纤维在血脂的调节和改善中扮演着重要角色，在一定程度上可以预防高血压、高血脂，减少心血管疾病的发生（谭亮等，2010；袁尔东等，2002）。此外，膳食纤维还有着抗癌作用，谷物和水果中的膳食纤维可以减少人体对致癌物质的吸收，从而有效地预防结肠癌等（李欣等，2013）。目前，国内对于膳食纤维的研究主要致力于食品和医疗方面（翟丽丽等，2014）。

我国是甘蔗种植和甘蔗制糖大国，在甘蔗收割时产生了大量的蔗梢，约占整根新鲜甘蔗的1/5，但研究开发甚少，只有少部分用作动物饲料和回田物料（李玉铭等，2018）。甘蔗叶中除了有黄酮类、酚酸类、酯类、萜类、糖类等功能性成分（何耀涛等，2016），还有大量的膳食纤维，纤维含量接近50%，是膳食纤维可靠的来源（周永升，2017）。然而蔗叶中的木质素会影响到动物饲料的适口性，因此蔗叶一般通过氨化、青贮或微贮处理后只用作反刍动物的饲料，这导致甘蔗叶饲料化开发利用进程缓慢（周志扬等，2021；郭永清等，2021；李标等，2020）。使用纤维素酶处理蔗叶，使胞内原生质暴露出来，同时纤维素酶水解甘蔗也能提高还原糖生成量，提高消化率，从而改善青贮甘蔗叶的品质（何晓妹，2015）。也有研究证明适量的蔗叶全价颗粒饲料能提高肉牛的生长性能（淡明等，2018）。目前，可以使用酶解法、化学法、物理法或微生物法处理蔗叶而提取或制备膳食纤维，再做成饲料，酶法相对其他方法所需要的试验条件温和，很少需要高温、高压等，对环境产生的污染小，并且得到的膳食纤维杂质较少（林杰等，2011；郑晓灵，2007）。本研究对蔗叶进行去除蛋白质、淀粉、脂肪、木质素后，在超声场中使用酶法制备蔗叶膳食纤维，通过单因素试验和Box-Behnken响应面法确定蔗叶膳食纤维的最佳工艺，并对比分析蔗叶水溶性膳食纤维（SDF）、蔗叶不溶性膳食纤维（IDF）和100目蔗叶粉末的堆积密度、持水力、持油力、溶胀性等指标，为提高甘蔗叶的有效利用和膳食纤维的研究提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1材料与设备 甘蔗叶是收集甘蔗尾叶与种植期间人为剥落部分的混合样品。酶制剂：热稳定α-淀粉酶（酶活≥3.5 U/mg，上海颖心实验室设备有限公司）、碱性蛋白酶（酶活≥200 U/mg，合肥博美生物科技有限责任公司）、脂肪酶（酶活≥30 U/mg，上海源叶生物有限公司）、纤维素酶（酶活≥100 U/mg，山东隆科特酶制剂有限公司）。其他试剂均为分析纯。仪器设备：FW177型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）、FA2004型分析天平（上海越平科学仪器有限公司）、SHZ-D（Ⅲ）型循环水多用真空泵（巩义市科瑞仪器有限公司）、GZX-GF101-3 BS型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）、HH-S8型恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）、H1850型台式高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2试验方法

1.2.1 甘蔗叶的预处理 参考林杰等（2011）的方法对甘蔗叶进行去除蛋白质、去淀粉、脱脂处理，参考Ann等（2020）、Llanes等（2019）、李春光等（2011）的方法去除木质素。（1）粉碎过筛：将蔗叶洗净去除杂质，干燥后粉碎并过40目筛。（2）去除蛋白质、淀粉：用相对于蔗叶粉末质量分数0.3%混合酶（蛋白酶和α-淀粉酶质量比为1∶3）溶液浸泡蔗叶粉末，其中液料比为20∶1、温度为65℃、酶解时间为90 min，过滤，再将酶解后的滤渣用蒸馏水洗净。（3）脱脂：将滤渣用脂肪酶进行酶解，脂肪酶用量为0.4%、温度为50℃、酶解时间为60 min，100℃灭酶10 min，再用蒸馏水将滤渣洗至中性，放入60℃烘箱烘干，过40目筛。（4）去除木质素：称取上述粉末，按液料比30∶1加入体积分数0.7%的H2O2和质量分数4%的NaOH混合溶液，在85℃下搅拌4 h，滤渣用蒸馏水洗净，60℃干燥后过40目筛；取碱液处理后的粉末，按液料比30∶1加入31 mL/L乙酸和9.5 g/L NaClO2混合溶液，在75℃下处理1 h，过滤后用蒸馏水洗涤至中性，60℃烘干后过100目筛，备用。

1.2.2 蔗叶膳食纤维的制备 称取1 g经过预处理的样品→加入液料比20∶1的蒸馏水→用乙酸、乙酸钠溶液调节pH为4→加入一定量纤维素酶→调节一定温度后使用500 W超声场中酶解一定时间→100℃水浴灭酶10 min→抽滤（滤渣经过清洗干燥后研磨过100目筛得到IDF）→滤液浓缩至约10 mL→加入约4倍体积预热至60℃的95%的乙醇，室温下醇沉1 h→抽滤→滤渣90℃干燥至恒重得到SDF。SDF得率代表着酶解程度的大小，因此以SDF得率为考察指标，SDF得率/%=SDF质量/预处理样品的质量×100。

1.2.3 酶解条件试验设计 按照1.2.2的制备步骤进行。考虑纤维素酶添加量（0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、酶解温度（40、45、50、55、60℃）、酶解时间（10、20、30、40、50 min）3个因素和水平。固定酶解温度50℃、酶解时间20 min，以SDF得率为指标，进行单因素试验得到最佳纤维素酶添加量，再依次确定最佳酶解温度和最佳酶解时间。

1.2.4 Box-Behnken响应面试验设计及验证试验

根据单因素试验结果，以SDF得率为指标进行三因素三水平Box-Behnken响应面试验，试验设计见表1。确定最佳制备工艺，并建立数学模型，分析因素间的相互作用。通过规划求解后得到酶解条件的理论值，重复5次实验，并进行t检验，检查工艺的稳定性、模型的准确性。

表1 Box-Behnken响应面试验设计

1.2.5 蔗叶膳食纤维的理化特性分析 参考巫永华等（2020）、李晗等（2020）和郝晓华等（2021）的方法，分别测定并比较蔗叶SDF、蔗叶IDF（酶解后的滤渣经过清洗干燥后研磨过100目筛）和100目蔗叶粉末的堆积密度、持水力、持油力、溶胀性。

堆积密度的测定：称取0.1000 g样品于5 mL离心管中，记录体积。堆积密度/（g/cm3）=样品质量/样品体积。

持水力的测定：称取0.1000 g样品于5 mL离心管中，加入1.5 mL蒸馏水，混匀，室温静置24 h，4000 r/min离心20 min，弃上清液，称重。持水力/（g/g）=（样品湿重-样品干重）/样品干重。

持油力的测定：称取0.1000 g样品于5 mL离心管中，加入市售大豆油2 mL，振荡摇匀，室温下放置1.5 h，4000 r/min的条件下离心30 min，除去上清液，称重。持油力/（g/g）=（样品吸油后重量-样品干重）/样品干重。

溶胀性的测定：称取0.2000 g样品，使用10 mL量筒量取体积后，将样品转移至50 mL量筒中，加入约25 mL蒸馏水，振荡均匀，室温静置24 h，观察样品的自由膨胀体积。溶胀性/（mL/g）=（吸水后样品体积-吸水前样品体积）/吸水前样品体积。

1.3数据处理 通过Excel 2016进行数据统计和表格制作，使用minitab 18进行标准偏差计算和多重比较分析（α=0.05），运用origin2018绘图。

2 结果与分析

2.1酶解条件单因素结果

2.1.1 纤维素酶添加量 由图1可知，SDF得率先显著上升后（P＜0.05）再趋于平缓。当酶添加量小于0.4%时，SDF得率随着纤维素酶添加量的增加逐渐上升，在酶添加量为0.4%时得率达到最大，为4.69%；当酶添加量添加至0.5%时，得率反而有所下降。因为酶解产物随着酶浓度地升高而升高，但当酶的浓度过大时，部分膳食纤维被进一步水解成低聚糖，该低聚糖不能被乙醇沉淀而降低SDF得率（巫永华等，2020；李晗等，2020）。经过多重比较发现，酶添加量0.3%和0.4%无显著差异（P＞0.05），基于低耗节能原则，确定酶添加量为0.3%。

图1 纤维素酶添加量对SDF得率的影响

2.1.2 酶解温度 由图2可知，SDF得率呈先上升后下降的趋势，并且具有统计学差异（P＜0.05）。温度过低时酶的活性较低，酶解效果不好，随着酶解温度的升高，酶的活性升高，SDF得率也在上升，在酶解温度达到50℃时，得率为4.64%。但当温度超过50℃时，因为温度过高导致酶的部分失活，同时也导致溶液的黏度变大会导致底物与酶的接触困难，使得SDF得率下降（巫永华等，2020；李晗等，2020）。因此，确定最佳酶解温度为50℃。

图2 酶解温度对SDF得率的影响

2.1.3酶解时间 由图3可知，SDF得率随着酶解时间的增加而上升，再趋于平缓。酶解时间的不足导致了纤维素不能充分分解，当酶解时间为20 min时，SDF得率最高为4.67%；当酶解时间超过20 min时，SDF得率有所下降。下降的原因可能是长时间在酶的水解和超声波的空穴效应、微机械效应及热效应的共同作用下使得膳食纤维发生降解成乙醇无法沉淀的低聚糖（巫永华等，2020；李晗等，2020）。经过多重比较发现，酶解时间20 min之后无显著差异（P＞0.05），同时基于低耗节能原则，确定酶解温度为20 min。

图3 酶解时间对SDF得率的影响

2.2 Box-Behnken响应面试验及验证试验结果与分析

2.2.1 响应面试验结果与分析 在单因素试验的基础上，以酶添加量、酶解温度和酶解时间为考察因素，以SDF得率为指标，设计Box-Behnken响应面试验，试验结果见表2。利用Design-Expert软件对试验数据进行分析，可以得到SDF得率（Y）的多项式回归方程（自然变量）。方程为：Y=-50.905+18.828A+2.064B+0.148C-0.065AB+0.110AC-8.500×10-4BC-26.650A2-0.02056B2-3.015×10-3C2。

表2 响应面试验结果

对回归方程进行方差分析，结果如表3所示。其中，F值可用于测试每个变量对响应值的意义。F越大，则相应变量的显著程度越高。当显著性检验P<0.05时，说明其具有统计学意义。从表3可以得出结论，模型P＜0.0001，该模型已达极显著水平；失拟项P=0.4423＞0.05（不显著），决定系数R2=0.9877，说明具有较高的显著性，而R2adj=0.9719，能够解释试验97.19%的响应值变化，且预测相关系数R2Pred=0.8999，CV=1.65，说明此试验模型与真试数据拟合程度良好，拟合度较高，可用于分析和预测蔗叶SDF的制备效果。回归方程系数的显著性分析：A、B、C、A2、B2、C2对SDF得率的影响达到极显著水平，AC对SDF得率的影响达到显著水平。酶解条件对SDF得率影响大小顺序为：C>A>B，即酶解时间>纤维素酶添加量>酶解温度。

表3 SDF得率回归方程的方差分析结果

图4是根据上述回归方程绘出的各因素交互作用对SDF得率影响的等高线图和响应曲面图。等高线越接近椭圆表明两因素交互作用越强，且等高线越密集则影响效果越大；响应曲面图呈凸面，直观地反映了这些因素对SDF得率的影响。在所研究的区域内均存在一个极值点，随着各因素从小到大变化，SDF得率呈现先增后减（或先增后缓）的趋势，这与单因素试验结果相一致。其中，结合表3可知，交互项AC的P值为0.0159，表明纤维素酶添加量和酶解时间之间的交互影响达到显著水平。

图4 各因素交互作用对SDF得率影响的等高线及响应面图

2.2.2优化酶解条件及验证结果与分析 通过对试验数据的处理与分析，并对方程进行规划求解，得到最佳酶解条件为：酶添加量0.3%、酶解温度49℃、酶解时间23 min，此时模型理论结果为SDF得率4.82%。进行5次重复试验，SDF得率分别为4.76%、4.66%、4.84%、4.74%和4.83%，SDF平均得率为4.766%，与模型预测结果接近。通过t检验分析（α=0.05），经过双尾检验可知重复试验值和预测值没有显著差异，再经过单尾检验可知重复试验的SDF得率没有显著减小，表明所建回归模型具有良好的预测效果。

2.3蔗叶膳食纤维理化特性分析结果 蔗叶SDF、蔗叶IDF和100目蔗叶粉末的堆积密度、持水力、持油力和溶胀性的测定结果见表4。这些是评价膳食纤维功能的重要指标，颗粒大小、形状和疏水－亲水相互作用都影响着这些指标（巫永华等，2020；李晗等，2020；郝晓华等，2021）。

表4 蔗叶膳食纤维及蔗叶粉末的理化特性测定结果

堆积密度反映样品的疏松程度，堆积密度越小，其结构越疏松，比表面积越大，表面活性的特性也越好。蔗叶SDF的堆积密度相对于蔗叶IDF和100目蔗叶粉末相比差异显著（P＜0.05），分别减少了24.72%、30.93%。

持水力和溶胀性较高，起到了促进肠道蠕动、使人产生饱腹感、增加粪便体积和水分的作用，这易于有害物质快速排出体外。蔗叶SDF的持水力相对于蔗叶IDF和100目蔗叶粉末相比差异显著（P＜0.05），分别增加了48.21%、86.82%。蔗叶SDF的溶胀性相对于蔗叶IDF和100目蔗叶粉末相比差异显著（P＜0.05），分别增加了9.89%、167.73%。这可能是因为超声和酶解打开了纤维素分子间的部分次级键，使亲水基团暴露，提高了水合性质。

膳食纤维对脂肪的结合能力是评价其对脂溶性组分吸附能力的重要指标。蔗叶SDF的持油力相对于蔗叶IDF和100目蔗叶粉末相比差异显著（P＜0.05），分别增加了97.10%、161.54%。这可能是超声和酶解处理破坏了纤维原有致密结构，使更多的亲水性基团和一些非极性基团同时暴露出来，从而提高了与脂肪的结合力。

3 结论

通过响应面结果可知，蔗叶SDF最佳制备的酶解条件为纤维素酶添加量0.3%、酶解温度49℃、酶解时间23 min，此时蔗叶SDF得率为4.82%。建立的数学模型与真实数据拟合度较高，可用于分析和预测蔗叶SDF的制备效果。在最佳工艺条件下制备的蔗叶SDF与蔗叶IDF、100目蔗叶粉末相比堆积密度、持水力、持油力和溶胀性都显著得到了改善。研究结果为蔗叶膳食纤维的开发和其在功能食品或动物饲料中的应用提供参考依据。