EXO1蛋白在DNA损伤中研究进展

吴珊 邱俊 陈俊宇 陈莹莹 王月婷 王楠 刘淑香 赵淑华

(1吉林大学第二医院，吉林 长春 130041；2空军航空大学门诊部；3吉林大学护理学院；4浙江大学医学院附属妇产科医院)

核酸外切酶(EXO)1兼有5'端-3'端外切酶及5'端结构特异性内切酶活性〔1〕，属于皮瓣结构特异性内切酶(Rad)2/着色性干皮病(XP)G组蛋白家族的成员。EXO1蛋白具有EXO1a及EXO1b两种异构体，其中EXO1b的C端额外具有48个氨基酸，因而活性明显优于EXO1a〔1〕，但两者的功能并无区别。

EXO1不仅参与DNA损伤细胞的周期调控和细胞凋亡的调节，还在DNA错配修复(MMR)、DNA双链断裂修复(DSBR)、DNA损伤应答(DDR)、DNA末端剪切及细胞分裂的重组修复中发挥重要作用。研究表明，EXO1基因缺陷可能增加乳腺癌、卵巢癌及肺癌等多种恶性肿瘤的易感性及化疗耐药性。此外，EXO1的多态性可预测胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、上皮性卵巢癌及非小细胞肺癌的预后〔2〕。本文就EXO1蛋白在DNA损伤中研究进展予以综述。

1 EXO1参与细胞周期调控

真核细胞发生DNA损伤时，调控DNA修复及细胞周期进程的信号通路激活，从而保持基因组的完整性〔3〕，EXO1可与多种细胞周期调节蛋白相互作用。在细胞增殖的S期，增殖细胞核抗原(PCNA)与EXO1表达共定位，通过与EXO1中的PCNA相互作用蛋白盒(PIP-box)结合，激活EXO1对双链DNA(dsDNA)的外切酶活性〔4〕。DNA损伤检测点Cdc25磷酸化可介导细胞G1/S期转化，并为14-3-3蛋白提供结合位点〔5〕。14-3-3蛋白具有多种异构体，在细胞信号转导、细胞凋亡及细胞分裂中发挥重要作用，其中，14-3-3η及σ可激活人EXO1蛋白。研究发现，结直肠癌细胞中14-3-3σ过表达可诱导G2期阻滞，在dsDNA末端剪切过程中14-3-3σ可抑制PCNA依赖的EXO1蛋白激活途径，DNA损伤时EXO1蛋白还可作为半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3的上游分子，参与细胞凋亡〔6〕。

2 EXO1参与DNA MMR

MMR是一种高度保守的DNA修复途径，通过更正DNA复制、修复及重组过程中出现的DNA碱基错配、插入和缺失环(IDLs)，维持基因组稳定性〔7〕。MMR分为两种途径，一方面，减数分裂重组蛋白(MRE)11、DNA交联修复蛋白(DCLRE)1C及FAN1 (FANCD2/FANCI-Associated Nuclease 1)不依赖EXO1直接参与MMR〔8〕。另一方面，EXO1蛋白的N端和C端分别与错配修复蛋白Muts同源体(MSH)3、MLH1 和MSH2相互作用，从而完成MMR〔9〕。MSH2和MSH6形成异二聚体MutSα，识别碱基错配和最多3 nt的IDL；MSH2和MSH3形成异二聚体MutSβ，识别13 nt大小的IDL，从而启动MMR〔10〕。之后，MutL同源体(MLH)1和MLH4形成具有内切酶活性的异二聚体MutLα，后者与PCNA及复制因子(RF)C一同聚集至错配位点，继而招募EXO1与MutSα(或β)及MutLα相互作用，对含有错配碱基的DNA链进行剪切。在此过程中，复制蛋白(RP)A通过调节EXO1蛋白对DNA的亲和力，确保剪切的安全性〔11〕。研究发现，EXO1敲除的细胞微卫星不稳定性(MSI)增加，EXO1基因缺陷小鼠的肿瘤易感性增加〔12〕。

3 EXO1参与DDR

DDR是一种复杂的DNA损伤修复机制，通过多种蛋白的参与，恢复DNA的完整性及保真性，维持其遗传稳定性。其中，FANA、B、C、E、F、G、L和M可启动DNA链间交联(ICL)修复，MSH2、MSH3、MSH6、MLH1和MLH4可启动MMR修复，XPC组、损伤特异性DNA结合蛋白(DDB)2和可卡因综合征蛋白(CS)A可启动核苷酸切除(NER)修复，Ku蛋白及MRE11-RAD50-NBS1(MRN)复合物可分别启动非同源末端连接(NHEJ)修复及同源重组(HR)修复，多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)可启动DNA单链断裂(SSB)修复。研究发现，EXO1敲除小鼠发生染色体断裂及碱基错配的概率升高，淋巴瘤易感性增加；EXO1null/null细胞的染色体不稳定，对电离辐射的敏感性高〔13〕。在DNA损伤修复的过程中，RPA与DNA损伤反应蛋白激酶ATM及ATR结合并发生磷酸化，从而参与DNA修复过程。有证据表明EXO1参与RPA的招募，通过HR修复维持基因组稳定性〔14〕。此外，PARP1合成的PAR不仅参与EXO1向DNA损伤位点的快速募集，也参与调节EXO1的外切酶活性〔15〕。同时，PARP1可与EXO1相互作用并激活EXO1的5'端剪切活性〔16〕。

4 EXO1与DNA末端剪切

在所有DNA损伤中，DNA双链断裂(DSB)对细胞的危害作用最强，如不及时修复，可阻断DNA复制、引起染色体缺失，进而导致细胞死亡或肿瘤转化。DSBR过程包括相互竞争的两种作用，一是Ku蛋白依赖的NHEJ途径，另一种是MRN复合物依赖的HR途径〔17〕。Ku70和Ku80异构体是构成NHEJ的重要成分，与双链DNA末端紧密结合，从而阻碍EXO1介导的DNA末端剪切，并防止核酸酶发生过度酶切〔17〕。而MRE11和SAE2〔人羧基末端结合蛋白反应蛋白(CtIP)的同源基因〕可阻止Ku70/80参与DSBR，从而促进EXO1的剪切〔18〕。此外，CtIP可直接与EXO1相互作用从而抑制后者的外切酶活性〔19〕。

DNA末端剪切是HR途径的重要步骤，主要通过两种途径进行，一种是RPA介导的DNA末端剪切途径，另一种是由EXO1介导，通过激活BLM、MRN及RPA而发挥作用。Bloom综合征解旋酶(BLM)可增加EXO1对DNA末端的亲和力，MRN则负责招募EXO1并增强其作用〔20〕。研究发现，MRE11、RAD50或奈梅亨断裂综合征蛋白(NBS)1基因缺陷具有致死性，而EXO1基因缺陷虽然对小鼠的存活几乎无影响〔13〕，但小鼠表现为严重的发育障碍、胚胎死亡及染色体不稳定，在细胞表型上表现为DNA复制、DNA修复、检测点信号及DDR方面的功能缺陷〔21〕。EXO1外切酶活性可被人RecQ解旋酶RECQL1、BLM及Werner综合征解旋酶(WRN)所激活〔22,23〕。然而，DNA末端被EXO1剪切的程度可能受到WRN、RPA、Ku70/80和(或)CtIP的限制〔24,25〕。此外，EXO1还通过微同源序列介导的末端连接，参与DNA剪切〔26〕。

5 EXO1与减数分裂重组修复

研究发现，小鼠需要 EXO1的酶切活性完成减数分裂Ⅱ期。EXO1null/null小鼠与野生型小鼠杂交后出现生育障碍〔12〕。相同大小或体重的EXO1null/null雄性小鼠的睾丸小于野生型小鼠。由于减数分裂Ⅱ期进展障碍，EXO1null/null雄性小鼠的精子发生存在缺陷〔13〕，但EXO1在减数分裂中维持基因稳定性的机制尚未明确。

6 EXO1与端粒维持

端粒位于染色体末端，通过端粒结合蛋白作用，防止DNA末端发生降解和DNA复制相关的损耗。端粒的末端携带t-loop结构〔27〕，通过与端粒特异性结合蛋白复合物shelterin如TFR1和TFR2、POT1、RAP1、TIN2、TPP1、MRE11、Ku70/80、BLM、WRN及RECQL4等紧密结合发挥作用〔28〕。缺乏功能性shelterin的细胞表现为染色体不稳定、端端染色体融合及端粒缩短。实验表明，端粒功能障碍是导致细胞周期阻滞的重要机制，可干扰细胞分裂，从而影响肿瘤形成〔29〕。然而研究发现，端粒功能失调的小鼠，EXO1缺失有助于维持器官稳定性并延长小鼠寿命，且不增加染色体不稳定性及肿瘤形成，表明EXO1缺失可能在端粒功能失调中具有延长生存期的作用〔30〕。

7 EXO1与年龄及恶性肿瘤的关系

EXO1缺失可影响基因组稳定性，并降低神经干细胞(NSCs)的增殖能力〔31〕，如EXO1null/nullNSCs表现出分化受损、嗅觉神经减少、微卫星和基因不稳定性增加等现象〔31〕，但EXO1并不直接与年龄增长或年龄相关疾病有关。

一些研究发现EXO1基因的单核苷酸多态性(SNP)与人类细胞中MSI及癌症易感性相关〔32〕。EXO1蛋白在正常组织中多呈低表达，且不随细胞周期及细胞增殖状态的改变而变化〔33〕。但其表达呈组织特异性，如在小鼠模型中，EXO1蛋白在睾丸及脾脏中高表达，而在甲状腺、淋巴结及骨髓组织中呈适度表达。在人类组织中，EXO1蛋白在甲状腺、结肠及胎盘组织均有表达，但在睾丸中表达度最高〔11〕。EXO1蛋白在一些肿瘤细胞中呈过表达〔34〕，是乳腺癌、卵巢癌、肺癌及胃肠道肿瘤的易感基因〔35〕，且可能与肿瘤的化疗耐药有关〔36〕。

8 总结与展望

EXO1蛋白同时具有内切酶及外切酶活性，不仅参与DNA损伤细胞的周期调控，调节细胞的凋亡，还通过与多种蛋白相互作用，参与MMR、DSBR、DDR、DNA末端切除与减数分裂和有丝分裂的重组修复等多种损伤修复，从而维持DNA的完整性及基因组的稳定性。EXO1基因缺陷与肺癌、乳腺癌及卵巢癌等多种恶性肿瘤的易感性密切相关，可作为肿瘤标志物用于高危人群筛查。此外，EXO1蛋白可能参与恶性肿瘤的化疗耐药，因此有望作为药物研发的靶点，提高耐药患者的化疗敏感性。但EXO1蛋白在端粒维持中的作用仍需深入探索，且EXO1蛋白在DNA损伤修复机制中的具体信号通路及在恶性肿瘤发生发展中的作用仍需进一步研究。