牡丹籽粕总黄酮提取工艺及其抗氧化活性研究

陈 晨，张焕新，王海波，江 娟

（江苏农牧科技职业学院 食品科技学院，江苏泰州 225300）

油用牡丹品种“凤丹”，由于出油率较高、结籽较多、适应性能力较强等优点，被视为食用油的良好来源[1]。2011年，牡丹籽油被作为一种健康营养的新型资源食品而备受青睐，但生产过程中，牡丹籽粕作为附属品却被直接丢弃，造成资源的虚耗和环境的破坏[2]。因此，研究牡丹籽粕中的功能性成分，对提高牡丹籽的综合利用率有着重要的影响意义。

牡丹籽粕中富含脂肪酸、多酚、多糖和黄酮类化合物等。其中的黄酮类物质抗氧化性极强，还具有稳定胆固醇、抗菌抗病毒等作用。本文以牡丹籽粕“凤丹”为原材料，通过单因素和正交实验优化牡丹籽粕总黄酮物质的提取工艺条件，还研究了牡丹籽粕黄酮类物质对DPPH 自由基、羟基自由基及超氧阴离子自由基的清除能力，考察其抗氧化能力，为进一步开发和利用牡丹籽粕奠定了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器设备

“丹凤”牡丹籽壳，众达合作社基地。

无水乙醇、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠、芦丁（HPLC ≥98%）和石油醚（30～60 ℃），上海沃凯生物技术有限公司。

T6 紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；RE-52D 旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHB-III 循环水式多用真空泵，上海越众仪器设备有限公司；KQ-250B 超声波清洗机，上海锦玟仪器设备有限公司；Labconoo FreeZone 6 L 型台式冻干机，广州赛拓仪器科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牡丹籽粕预处理

将牡丹籽粕置于粉碎机中粉碎，过80 目筛。取适量牡丹籽粉加石油醚于60 ℃恒温水浴锅中索氏抽提10 h。脱脂完成、晾干后放入45 ℃的烘箱中，低温烘干8 h，取出冷却到室温，备用。

1.2.2 牡丹籽粕总黄酮提取物制备

准确称取1.0 g 牡丹籽粕，将牡丹籽粕粉与乙醇混合均匀。置于超声波清洗器中超声辅助提取，提取完成之后，将提取液过滤。滤液在65 ℃下旋转蒸发直至无溶液蒸出，冷冻干燥，制成提取物冻干粉，冷藏备用。

1.2.3 牡丹籽粕总黄酮得率测定

用硝酸铝-亚硝酸钠比色法[3-4]测定牡丹籽粕总黄酮物质含量，以芦丁为标品，于510 nm 处测定吸光值，绘制标准曲线。

（1）标准曲线绘制方法。精确量取0.1 mg·mL-1芦丁标准品0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL 和0.60 mL 置于5 mL 离心管，分别加入2 mL 蒸馏水及0.15 mL 5%NaNO2溶液，搅拌均匀，放置6 min，添加0.15 mL 10% Al(NO3)3·9H2O 溶液，5 min 后添加2 mL 4%的NaOH 溶液，再将体积固定到5 mL，摇匀后静置30 min，于510 nm 处测量吸光值。以浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

（2）样品总黄酮提取率的测定。精确称量10 mg 的牡丹籽粕总黄酮提取物，加入蒸馏水定容至10 mL，充分振荡摇匀后过滤。弃去初滤液，精准吸取2 mL续滤液，用制作标曲的方法测定样品。每组实验重复3 次，黄酮提取率计算公式为

式中：X为根据回归方程所得总黄酮含量，μg；V1为提取总黄酮所用溶液的总体积，mL；V2为测定总黄酮时所用的体积，mL；M为加入牡丹籽粕醇提物质量，mg。

1.2.4 单因素与正交实验

准确称量1.0 g 的牡丹籽粕若干份，分别考察料液比为1∶30、1∶40、1∶50、1∶60和1∶70（g∶mL），乙醇浓度为40%、50%、60%、70%和80%，超声功率为200 W、250 W、300 W、350 W 和400 W，超声温度为20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃和60 ℃以及超声时间为30 min、40 min、50 min、60 min 和70 min对总黄酮提取率的影响。根据单因素实验结果，以牡丹籽粕总黄酮的提取率为考察指标，在乙醇浓度为60%、超声温度为40 ℃的条件下，选用A超声功率、B超声时间以及C料液比进行L9(33)的正交实验以优化牡丹籽粕中的总黄酮提取工艺。正交实验因素与水平设计见表1。

表1 正交实验因素与水平设计

1.2.5 牡丹籽粕总黄酮体外抗氧化性测定

在上述正交实验得出最佳工艺条件后，在此条件下制备牡丹籽粕总黄酮，并分别测定其对DPPH自由基、羟基自由基、超氧阴离子自由基的清除能力。

（1）DPPH 自由基清除率的测定。将牡丹籽粕总黄酮制成0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的待测样品溶液，分别取3.0 mL 样品溶液，加入1 mL 0.2 mmol·L-1的DPPH 乙醇溶液，并搅拌均匀，在常温下避光放置30 min 后，于517 nm 波长下测定其吸光度值Ai[5]；以3.0 mL 无水乙醇替代样品作为空白组，其余处理同上，测定吸光度值为A0；以1 mL 无水乙醇代替DPPH 乙醇溶液作为对照组，其余处理同上，测定吸光度值Aj。以相同质量浓度的维生素C 溶液作为阳性对照。DPPH 自由基清除率的计算公式为

（2）羟基自由基清除率测定。分别取2 mL 0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的牡丹籽粕总黄酮样品溶液，再分别加入2 mL 2 mmol·L-1的FeSO4溶液、2 mL 1 mmol·L-1的H2O2溶液、3 mL 6 mmol·L-1的水杨酸溶液以及2 mL 的蒸馏水于试管中，并混合均匀，37 ℃水浴30 min，于517 nm 波长下进行吸光度值测定，记为A2[6]；空白组不加样品溶液，其他处理同上，测吸光度值记为A0；用蒸馏水替代水杨酸溶液，所测吸光度值记为A1。以相同质量浓度的维生素C 溶液作为阳性对照。羟基自由基清除率的计算公式为

（3）超氧阴离子自由基清除率的测定。取6.0 mL Tris-HCl（50.0 mmol·L-1，pH 8.2）于试管中，25 ℃水浴20 min，分别加入2.0 mL 0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1和1.2 mg·mL-1的牡丹籽粕总黄酮溶液，再添加0.8 mL 5.0 mmol·L-1的邻苯三酚溶液，摇匀，25 ℃水浴4 min，使用0.2 mL HCl 溶液（8 mol·L-1）终止反应，在320 nm 处测定吸光度记为Ai；以70%聚乙二醇溶液替代样品溶液作为空白组，吸光度为A0；以蒸馏水替代邻苯三酚作为对照组，吸光度为Aj。以相同质量浓度的维生素C 溶液作为阳性对照。超氧阴离子自由基清除率的计算公式为

1.2.6 数据处理

用Minitab 17 软件进行正交实验设计和回归分析，用SPSS 23 对实验数据进行差异分析，通过Origin 2018 和Excel 绘制图表。

2 结果与分析

2.1 各因素对牡丹籽粕总黄酮提取率的影响

由图1（a）可知，料液比对牡丹籽粕总黄酮提取率的影响较大。料液比过小，总黄酮提取不够充分。料液比过大时，总黄酮得率降低，易造成杂质也被提取出来，影响提取物的纯度[7]。在料液比为1∶50（g∶mL）时，牡丹籽粕中的总黄酮含量最高。由图1（b）可知，随着乙醇浓度的升高，总黄酮提取率先升高后下降。当乙醇浓度为60%时，总黄酮的提取率最高，为9.92%。当乙醇浓度较高时，牡丹籽粕的醇溶性和脂溶性物质的溶出量增大，影响黄酮类物质的溶出，从而导致黄酮得率的降低[8]。如图1（c）所示，当超声功率为250 W 时，总黄酮提取率最高，达到10.96%。当逐渐加大超声功率时，由于过大的功率造成了强烈的分子运动，使得大分子杂质也被加速溶解出来，影响黄酮提取率[9]。如图1（d）所示，若超声温度过低时，总黄酮的提取效率低。若超声温度过高，黄酮类物质易受高温破坏，影响其生物活性和稳定性。当超声温度为40 ℃时，总黄酮提取率最高。如图1（e）所示，当超声时间在30～50 min时，随着超声时间的延长，牡丹籽粕与酒精充分混合，加速了黄酮类物质溶解。当超声时间为50 min 时，总黄酮提取率最高，可达10.76%。但超声时间超过50 min 后，会出现黄酮分解或其他大分子溶解现象，导致总黄酮提取量逐渐降低。

图1 各因素对牡丹籽粕总黄酮提取率的影响

2.2 正交实验结果

由表2可知，影响牡丹籽粕总黄酮提取量的3个因素中，超声功率的作用最大，料液比次之，超声时间作用最小，即A＞C＞B。根据K值大小可知，牡丹籽粕总黄酮提取的较优方案是A2B2C2，即超声功率250 W，超声时间50 min，液料比1∶50（g∶mL）。

表2 L9(33)正交实验结果

2.3 最佳提取条件的确定及验证实验

对表2的正交实验结果进行回归分析，得出总黄酮提取率的回归公式为Y= 10.584 4+0.002 2A1+0.458 9A2-0.461 1A3-0.024 4B1+ 0.085 6B2-0.061 1B3-0.127 8C1+0.302 2C2-0.174 4C3，对上述回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 方差分析结果

由表3可知，超声功率、超声时间以及料液比对总黄酮提取率的影响均显著（P＜0.05）。由F值大小可以看出，影响牡丹籽粕蛋白质得率的因素的大小顺序为A＞C＞B，即超声功率＞料液比＞超声时间。

在乙醇浓度为60%，超声温度为40 ℃，超声功率为250 W，超声时间为50 min，料液比为1∶50的条件下，重复进行3 次实验，牡丹籽壳总黄酮提取率为（11.50±0.13）%，说明此提取工艺可靠，具有参考价值。

2.4 牡丹籽粕总黄酮提取物的体外抗氧化活性测定结果

2.4.1 牡丹籽粕总黄酮对DPPH 自由基清除力的影响

由图2可知，在当牡丹籽粕总黄酮提取物浓度低于0.8 mg•mL-1时，其清除率随着提取液浓度的增大而增加。当提取物浓度为0.8 mg•mL-1时，DPPH自由基清除率最高，为78.71%。当提取物浓度高于0.8 mg•mL-1时，DPPH 自由基的清除效果趋于平稳。此外，牡丹籽粕总黄酮DPPH 自由基清除能力高于维生素C 溶液。

图2 牡丹籽粕总黄酮对DPPH 自由基清除率的影响

2.4.2 牡丹籽粕总黄酮对羟基自由基清除力的影响

羟基自由基是一种机体内的重要活性氧，其能够和细胞内各种有机物进行反应，通过破坏脂肪、蛋白质和核酸代谢来损伤细胞的结构和功能，从而将其分解、降解，最终清除[10]。由图3可知，牡丹籽总黄酮提取物质量浓度在0.1～0.6 mg·mL-1时，对羟基自由基的清除率逐渐增加。当提取物浓度在0.6 mg·mL-1时，清除率为45.83%。随着总黄酮提取物浓度的继续增加，其对羟基自由基的清除率影响不大。与维生素C 溶液相比，牡丹籽粕黄酮提取物对羟基自由基的清除能力稍弱，但也具备一定的清除作用。

图3 牡丹籽粕总黄酮对·OH 清除力的影响

2.4.3 牡丹籽粕总黄酮对超氧阴离子自由基清除力的影响

由图4可知，牡丹籽粕总黄酮提取物浓度在0.1～0.4 mg·mL-1时，其清除·O2-的能力缓慢增加。在0.4～0.8 mg·mL-1的质量浓度下，其清除速率呈现直线上升趋势，最高达57.62%。而后随着总黄酮提取物质量浓度的不断提高，其清除速率基本保持不变。此外，牡丹籽粕总黄酮对•O2-的清除能力总体弱于维生素C 溶液。

图4 牡丹籽粕总黄酮对•O2-清除力的影响

3 结论

本研究通过单因素和正交实验，确定了牡丹籽粕总黄酮的最佳提取工艺。在料液比为1∶50，乙醇浓度为60%，超声功率为250 W，超声温度为40 ℃，超声时间为50 min 条件下提取，牡丹籽粕中的总黄酮提取率为（11.50±0.13）%。

根据抗氧化活性实验结果可知，牡丹籽粕黄酮提取物对DPPH 自由基、羟基自由基以及超氧阴离子自由基均有良好的清除能力，说明牡丹籽粕黄酮类提取物有着很好的抗氧化性能。本实验结果为牡丹籽粕的综合开发利用提供了理论支持，为研究牡丹籽粕中活性物质奠定了一定的基础。