三七总皂苷预处理通过激活HIF-1α/BNIP3线粒体自噬信号通路减少心肌细胞H/R损伤的机制研究

王丽红 韩勇 王超海 詹舟虹 卢梦恺 金佳炜 刘新文

绍兴文理学院附属医院（绍兴市立医院）药剂科，浙江绍兴 312000

心肌缺血缺氧导致心肌细胞损伤，随后恢复血流和氧气产生大量氧自由基，这种心肌细胞缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）过程会造成大量心肌细胞凋亡，引起心肌损伤，减少心肌细胞H/R 损伤是改善患者预后的保障[1,2]。线粒体自噬是细胞自发清除损伤或衰老线粒体的过程，近年研究发现线粒体自噬与神经退行性疾病和癌症等诸多生理病理过程密切相关，这对修复心肌细胞H/R 损伤有重要意义，与线粒体自噬相关的信号通路也逐渐引起研究者的关注[3,4]。低氧诱导因子-1α（hypoxic inducible factor-1 α，HIF-1α）是细胞氧气信号传导通路的核心组成部分，常氧下HIF-1α 表达极为有限，仅在低氧条件下能够实现稳定高表达，HIF-1α 蛋白参与代谢、缺氧适应、血管生成和炎症发展等重要过程[5]。B 淋巴细胞瘤-2/腺病毒E1B 19kDa 相互作用蛋白3（b lymphocytoma-2/adenovirus E1B 19kDa interacting protein 3，BNIP3）能发挥促细胞凋亡和线粒体自噬的重要作用，因此，通过调节HIF-1α/BNIP3 线粒体自噬信号通路表达，能够调控线粒体自噬过程，进一步在减少心肌细胞H/R 损伤中发挥作用[6]。研究表明，三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）可以通过抑制细胞凋亡减少心肌缺血细胞，缩小心肌梗死范围，抑制血小板聚集黏附以及改善微循环，但其保护心肌的具体作用机制尚无定论[7,8]。本研究探讨了PNS 是否通过调节HIF-1α/BNIP3 线粒体自噬信号通路发挥减少心肌细胞H/R损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

人H9c2 心肌细胞购自上海博湖生物科技有限公司；PNS 和二甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol，2-ME2）由上海广锐生物科技有限公司提供；DMEM培养基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自江苏齐氏生物科技有限公司；酶联免疫试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司；β-actin 人单克隆抗体LC3、HIF-1α 和BNIP3 单克隆抗体，均购自美国Abcam 公司。CO2培养箱购自ThermoFisher Scientific公司；Infinite 200 PRO 多功能酶标仪购自瑞士TECAN 公司；荧光显微镜购自日本Olympus 公司。

1.2 细胞培养

采用含质量分数10% FBS 的DMEM 培养液培养H9c2 心肌细胞，于37℃、5% CO2培养箱中培养，隔天换液，使培养的H9c2 心肌细胞完全贴壁。

1.3 H9c2 心肌细胞H/R 损伤模型建立与分组

1.3.1 H/R 损伤建模方法 待H9c2 心肌细胞完全贴壁后，弃去细胞培养液，每孔加入100μl 不含FBS的无糖DMEM 培养基（细胞缺氧液），将细胞培养板转移至密闭缺氧盒中，持续通氮气10min 除去氧气，置于CO2培养箱中缺氧培养3 h，然后除去细胞缺氧液，每孔加入100μl 体积分数10%FBS 的高糖DMEM 培养基，将细胞培养板置于CO2培养箱中复氧培养[9]。

1.3.2 分组 ①对照组：即正常心肌细胞组，按照1.2 步骤常规培养H9c2 心肌细胞；②模型组：即经过缺氧培养的H/R 损伤的细胞组，根据上述1.3.1 的H/R 损伤模型的建立方法，建立H/R 损伤模型，模型组仅建模，不加任何药物干预；③2-ME2 组：即在含2-ME2 培养液中培养H/R 损伤的H9c2 心肌细胞；④PNS组：建立模型的基础上，在培养液中加入PNS(50μg/ml)，PNS 浓度根据文献和预实验决定；⑤P NS+2-ME2 组：在培养液中加入2-ME2，10min 后加入PNS(50μg/ml)，培养H/R 损伤的H9c2 心肌细胞。

1.4 心肌细胞损伤检测

采用酶联免疫吸附法测定肌酸激酶（creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate amino transferase，AST）水平。将包被好的酶标板用PBS缓冲液冲洗3 次，缓冲液封闭，每孔100μl，37℃下放置30min。封闭好的板加标准品或待测H9c2 心肌细胞悬浮液各3 孔，每孔50μl，室温放置4h，每孔加入50μl 酶标抗体，室温反应1h，加入底物邻苯二酚胺1 滴显色，带标准曲线梯度明显时用硫酸终止反应，读取490nm 下吸光度值，所有操作严格按照说明书要求执行[10]。

1.5 心肌细胞自噬活性检测

取各组对数生长期H9c2 心肌细胞培养48h 后弃培养基，质量分数4%甲醛固定10min，200μl Triton-X作用30min，采用3%FBS 封闭，加入细胞自噬标志物LC3 一抗孵育过夜，加入荧光耦联二抗，37℃孵育1h 后封片，荧光显微镜下观察LC3 荧光斑点数。

1.6 线粒体自噬信号通路表达检测

取各组H9c2 心肌细胞，采用细胞裂解液裂解，提取总蛋白，严格按照操作说明进行。采用BCA 法进行蛋白定量，取50ng 蛋白进行SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，室温封闭2h，采用洗膜缓冲液洗膜并加一抗（LC3、HIF-1α 和BNIP3），于4℃孵育过夜，洗膜加二抗，于室温下孵育2h。电化学发光显影，用凝胶图象处理系统分析对比条带强弱，选用β-actin作为内参[11]。

1.7 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件对数据进行处理分析，满足正态性的计量资料以均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理后心肌细胞损伤比较

与对照组相比，模型组CK、LDH 和AST 水平均明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，PNS 组和PNS+2-ME2 组CK、LDH 和AST水平均明显降低，2-ME2 组明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 不同处理后心肌细胞损伤比较（ ）

表1 不同处理后心肌细胞损伤比较（ ）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05

2.2 不同处理后心肌细胞氧化应激比较

与对照组相比，模型组ROS 含量和MDA 水平均明显升高，SOD 含量显著下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，PNS 组和2-ME2+PNS组MDA 水平和ROS 含量明显降低，SOD 含量明显升高；2-ME2 组MDA 水平和ROS 含量明显升高，SOD含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 不同处理后心肌细胞氧化应激比较（ ）

表2 不同处理后心肌细胞氧化应激比较（ ）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05

2.3 不同处理后心肌细胞自噬活性比较

免疫荧光实验检测结果显示，与对照组相比，模型组心肌细胞LC3荧光斑点数明显增加（P＜0.05）；与模型组相比，PNS 组和2-ME2+PNS 组心肌细胞LC3 荧光斑点数明显增加，2-ME2 组LC3 荧光斑点数明显减少（P＜0.05），见图1。

图1 不同处理后心肌细胞自噬活性比较

2.4 不同处理后心肌细胞线粒体自噬信号通路表达比较

与对照组相比，模型组LC3、HIF-1α 和BNIP3表达水平明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，PNS 组和PNS+2-ME2 组LC3、HIF-1α 和BNIP3 表达水平明显升高，2-ME2 组明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2，表3。

图2 心肌细胞线粒体自噬信号通路表达比较凝胶条带

表3 不同处理后心肌细胞线粒体自噬信号通路表达比较（ ）

表3 不同处理后心肌细胞线粒体自噬信号通路表达比较（ ）

注：与对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，#P＜0.05

3 讨论

AST 在心肌内含量丰富，对诊断心肌梗死等疾病有一定意义；发生心肌损伤时，胞内物质外漏至细胞间液及外周血中，造成LDH 升高；CK 在各种类型进行性肌萎缩时活性增高[12,13]。本研究结果显示，经PNS 干预后心肌细胞损伤有所缓解。PNS 预处理能够降低心肌细胞CK、LDH 和AST 水平，说明PNS 具有心肌保护作用，而2-ME2 组上述水平明显增加，说明2-ME2 一定程度上会损害心肌细胞，PNS+2-ME2 组CK、LDH 和AST 水平升高说明PNS能够逆转2-ME2 的损伤作用。氧化应激研究结果表明模型组心肌细胞氧化应激水平较高，这可能是其心肌细胞受损严重程度高的可能原因之一。使用PNS预处理后，心肌细胞内的氧化应激水平有所缓解，2-ME2 减轻H/R 引起的心肌细胞凋亡，对H/R 损伤的心肌细胞具有显著保护作用。

LC3 参与自噬体形成，是自噬的重要分子标志物之一，为了从自噬的角度进一步解释这种现象，本研究采用免疫荧光实验检测各组心肌细胞自噬活性[14]。本研究结果显示模型组和经PNS 干预的心肌细胞自噬活性均明显升高，这可能是因为当心肌细胞受损后，机体为代偿性修复损伤而激活心肌细胞自噬过程，而PNS 则推进了自噬进程以促进更高效的保护作用。既往研究结果显示，自噬在缺血再灌注过程中具有双向调节作用，这种作用效果取决于对自噬的刺激程度，适度自噬可以清除受损细胞器发挥保护作用，而过度的自噬水平则会进一步损伤心肌细胞[15]。多数研究者认为H/R 发生的基础是能量代谢障碍，而线粒体是体内能量代谢的主要场所，其功能损伤能够直接导致机体能量代谢异常[16]。线粒体对缺氧导致的损伤极为敏感，缺氧早期受损线粒体常通过选择性自噬发挥保护作用。HIF-1α 作为低氧反应过程中的核心因子，在介导低氧信号通路中发挥着至关重要的作用。同时，BNIP3 作为一种线粒体外膜蛋白，在缺氧条件下其表达增加也会促进线粒体自噬以清除受损线粒体[17,18]。2-ME2 是不可逆HIF-1α 通路抑制剂，能够使微管解聚并抑制HIF-1α 核积累以及HIF 转录活性，抑制线粒体自噬过程，本研究结果显示，使用2-ME2 干预后再加入PNS，这种线粒体自噬效应被逆转，这一结果从分子学角度说明PNS 能通过作用于HIF-1α/BNIP3 线粒体自噬信号通路，引起线粒体选择性自噬，快速清除体内受损线粒体，更有效地保护心肌细胞[19]。既往研究显示，BNIP3 在正常生理条件下处于低表达水平，而当细胞缺氧时，活化的 HIF-1α 通过上调BNIP3 引起自噬调控蛋白Beclin1 从B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）基因中解离，释放Beclin1 激活自噬，与本研究结果基本一致[20]。

综上所述，本研究分析了 PNS 能够作用于HIF-1α/BNIP3 线粒体自噬信号通路发挥减少心肌细胞H/R 损伤的作用，推进了临床利用线粒体自噬通路提供相关治疗的进展。