环孢霉素和他克莫司检测试剂注册审评要点

郑秀娥 崔涛 郭金双 杨阳 李国勇 王玉 夏文龙 山东省食品药品审评查验中心 （山东 济南 250014）

内容提要： 环孢霉素和他克莫司检测试剂作为风险比较高的第二类体外诊断试剂，在体外诊断中具有重要的临床检测意义。基于该类药物检测试剂的特殊性，文章旨在通过对产品在注册技术审评过程中的要点分析，对注册申请人在产品的研发和注册过程中提供一些思路和帮助。

环孢霉素和他克莫司作为常用的免疫抑制剂，主要用于抗器官移植排斥反应，还可应用于治疗某些自身免疫性疾病，临床应用较广。由于环孢霉素和他克莫司生物利用度个体差异大，血药浓度与疗效及毒性密切相关，且血药浓度易被多方面因素影响，定时对患者体内环孢霉素和他克莫司的血药浓度监测，制定个体化给药方案，对提高器官移植的存活率，促进环孢霉素和他克莫司在临床的合理应用具有重要的临床意义。目前临床检测环孢霉素和他克莫司的常用方法包括化学发光法、酶联免疫法、荧光免疫层析法、（超）高效液相色谱-串联质谱法、免疫比浊法等。其中以高效液相色谱-串联质谱法、化学发光法和荧光免疫层析法为主，不同方法学产品有各自的优缺点，可以满足不同等级医疗机构、不同应用环境下的临床使用要求。据统计，全国范围内，此类已批准上市的产品10余个，正在研发或者准备申报注册的产品有很多，因此本文对注册申请人在产品的研发和注册申报具有非常重大的意义。

1.适用范围及管理类别

本文所指环孢霉素和他克莫司检测试剂是用于体外定量检测人体全血中环孢霉素和他克莫司的含量。全血是与器官移植相关重要科研组在共识声明中推荐使用的基质[1-4]。如使用其他基质进行检测，则需要利用源于药物治疗患者的样本进行研究证明与全血中分析物具有较强相关性。该产品在《体外诊断试剂分类规则》中属于药物及药物代谢物检测的试剂，管理类别为Ⅱ类，境内注册人应向各省、自治区、直辖市药品监督管理部门申报该产品，境外注册人应向国家药品监督管理局申报该产品，并应按照《体外诊断试剂注册申报资料要求及说明》的要求提交注册申请资料。

2.非临床部分

2.1 产品风险管理分析

目前尚不清楚环孢霉素和他克莫司产品对患者健康造成的直接风险，但无法正确进行测试或结果解释存在错误可能对患者造成不当管理风险。错误地低报环孢霉素或他克莫司测定结果可能会作出将剂量升高到超出治疗获益剂量的决定，这可能会增加药物毒性风险；而错误地高报环孢霉素或他克莫司测定结果则可能作出将剂量降低到免疫抑制所需剂量之下的决定，这可能增加植入器官排斥的风险。对于环孢霉素或他克莫司，目前尚无固定的治疗范围。患者的最佳治疗范围取决于诸多因素，如移植物类型、患者敏感性、合并用药和移植后的时间以及所采用具体商业化分析的代谢物交叉反应性。因此，根据测定结果来调整治疗方案而不考虑其他临床因素可能构成一定的风险。

进行风险分析时，应识别出产品的其他特定风险，并对风险分析方法进行描述。如果可以选择使用其他方法来解决所识别出的特定风险，或已识别出不同于本指南中风险的其他风险，应提供详细信息来支持所采用的、解决该风险的方法。

2.2 分析性能研究

该产品应在有效质量管理体系下生产且质量稳定，其主要原材料、生产工艺经过选择和确认后才可进行性能研究及注册申报。如果声称适用不同机型，则需要在不同机型上（酶标仪除外）分别进行性能研究。

由于患者样本能真实反映游离药物和结合药物、代谢产物以及其他合并服用的药物对产品检测结果的影响，性能评估时应尽可能纳入预期使用人群（即摄入环孢霉素或他克莫司的患者）的样本进行评价。确需使用加标样本进行研究时，应提供关于药品纯度、代谢产物或潜在干扰物质、样品类型的信息等。添加分析物时，加入体积应尽可能少，并应确保在每项分析中都包含所有的分析步骤（如细胞裂解、提取和离心等）。

分析性能评估主要包括样本稳定性，适用的样本类型，校准品的量值溯源和质控品的赋值，准确度/正确度，精密度，空白限、检出限及定量限，分析特异性，高剂量钩状效应，测量区间及可报告区间，反应体系等项目的研究资料，应当采用多批产品进行性能评估。

2.2.1 样本稳定性

应充分考虑实际使用过程中样本采集、处理、运输及保存等各个阶段的条件，对样本的稳定性进行评价并提交研究资料。内容包括建议的保存条件、允许的冻融周期、添加剂（如抗凝剂）和运输条件（如涉及）等。

2.2.2 校准品的量值溯源和质控品的赋值

应明确申报产品适用的校准品和质控品。对试剂配套校准品的量值溯源进行研究（如溯源链及逐级传递过程），对质控品赋值及其质控范围如何确定进行研究（应当提交在所有适用机型上进行赋值和验证的资料）。同时，应对校准品的性能指标进行评估，如果校准品/质控品的基质不同于临床常用样本类型（血清、血浆、尿液等），还应提交基质效应的研究资料。

2.2.3 正确度

正确度指无穷多次重复测量所得量值的均值与参考量值的一致程度。正确度一般由系统测量误差决定，用偏倚来表示，可采用方法学比对（与对比试剂、参考测量程序或诊断准确度标准比较）、参考物质检测或回收试验等方式。

使用参考物质的正确度评价是优先推荐的方法，一般以相对偏差来表示，目前该产品无相应国家标准品发布，如有，则优先采用国家标准品进行准确度研究。参考物质包括具有互换性的有证参考物质、公认的参考品、标准品，参考测量程序/参考方法赋值的临床样本等。

使用患者样本的正确度评价时，应采用参考测量程序或临床应用广泛、质量得到普遍认可的已上市同类试剂进行比对，如条件允许，建议与具有相同溯源性的分析系统作比对。申报试剂和对比方法同时检测患者样本，通过比较两种方法之间的系统误差，对申报试剂进行正确度评价。应在多天进行检测，患者样本的浓度水平应覆盖申报试剂的测量范围并尽量均匀分布。

当采用回收实验时，将已知量的环孢霉素或他克莫司添加到不含药物或含有已知药物浓度的临床样本中（包括向服用环孢霉素或他克莫司患者样本中加标），配制成回收样品，进行检测。加标样本的终浓度应覆盖大部分的线性范围。应当检测至少三个水平的回收样品，代表试剂测量范围的高、中、低浓度，每个浓度重复检测（至少3～5次重复）。

2.2.4 精密度

精密度反映的是多次测定结果之间接近的程度，由随机测量误差决定，通常用标准差、方差或变异系数表示，主要包括重复性、中间精密度和再现性。建议对检测范围内至少3个浓度水平的精密度进行评估。3个浓度分别为：①治疗效果不佳范围或可报告范围下限；②在治疗范围内的浓度；③接近可报告范围或毒性范围的浓度。精密度研究可能涉及多天、多地点检测，应确保样本的稳定性和一致性，可将样本等分保存。具体研究方法建议参考相关文件等。

研究时应注意样本类型（例如，患者样品、加标样本等）、时间（天数、运行次数）、仪器、运行/分析批、地点、环境条件（实验室温度、湿度、空气质量、管理等条件）、校准（校准品批次，校准周期）、试剂批次、操作者等对研究结果的影响。

2.2.5 分析特异性

应评估分析待测样本中和试剂使用过程中潜在的交叉反应和干扰物质，并对干扰和交叉的程度进行量化。

2.2.5.1交叉反应研究环孢霉素包含的代谢物有AM1，AM4n，AM9，AM19，AM1c，AM1c9。他克莫司包含的代谢物有MⅠ，MⅡ，MⅢ，M Ⅳ，M Ⅴ，M Ⅵ，M Ⅶ，M Ⅷ。应当尽可能对以上代谢物进行研究。这些研究涉及将代谢物加标到不含药物的全血中，对加标样品的重复性进行评估并对所用代谢物的浓度进行描述。

2.2.5.2干扰物质研究

干扰物质研究应当考虑常见的内源性干扰、外源性干扰和已有报道的干扰物质等对产品检测结果的影响。

该类产品常见的干扰物包括但不限于以下物质：①常见的内源性干扰物质包括胆红素、甘油三酯、胆固醇、尿酸、类风湿因子、血细胞容积率、白蛋白、丙种球蛋白、人抗鼠抗体等。②常见的外源性干扰物质包括样本添加剂（抗凝剂或防腐剂），常见的合并用药包括但不限于：环孢霉素、他克莫司、霉酚酸及其代谢物（MPAG）、雷帕霉素、一般非处方药等。

注册申请人除对添加干扰物的样本进行研究外，亦可采用患者标本通过对比申报试剂与其他测量程序的检测结果，进行干扰影响的评价。

2.2.6 线性区间

首先应通过对浓度已知的样本进行评估以确定检测的线性区间。选择的样本浓度应均匀分布在试验的线性区间内，适当的重复次数和浓度水平取决于检测的可报告区间。建议选择7～11 个不同浓度样本（建议用高值和零浓度/低值浓度的样本按比例精确配制），比预期线性区间宽20%～30%，每个浓度样本检测2～4次。逐渐减少浓度点，直到有可接受的线性区间。

对于跨越更宽浓度范围的环孢霉素，应对额外浓度水平进行评估（例如，以50ng/mL为增量）。

如声称对超出线性区间浓度的样本可以进行稀释后再检测，那么应研究适用的稀释液和声称的稀释倍数，从而确定试剂的可报告区间。

2.2.7 空白限（LoB）、检出限（LoD）与定量限（LoQ）

应当包括建立和验证两部分内容。LoB，LoD，LoQ的研究需选择多个样本（空白样本、低浓度水平样本、已知浓度的低水平样本），在多天内进行研究。定量限应考虑偏倚和精密度的要求，满足预设准确度指标。

2.2.8 高剂量钩状效应（如适用）

一些免疫测定方法可能表现出“高剂量钩状效应”，即在高浓度时，待测物浓度与响应度呈现出与校准曲线相反的数量关系。在适用情况下（例如，双位点或夹心免疫测定法），应将线性区间研究扩展到可报告区间之外，达到可能在临床条件下遭遇的最高浓度，以评估该试剂是否存在高剂量钩状效应并提交研究资料。

2.3 稳定性研究

一般应包含研究方案、报告和数据。

2.3.1 实时稳定性（货架有效期）

对至少三批产品在实际储存条件下保存至成品有效期后的实时稳定性进行研究。明确储存的环境条件（如温度、湿度和光照）及有效期。

2.3.2 使用稳定性

对产品实际使用期间的稳定性进行研究，包括所有组成成分的开封稳定性，适用时还应对复溶稳定性、机载稳定性及组分的冻融次数进行研究。如果涉及校准品，还应该提交校准频率或校准稳定性的研究资料。研究过程中需明确产品使用的温度、湿度条件等。

2.3.3 运输稳定性

对申报产品可在特定或者预期的条件下运输进行研究，应说明产品正确运输的环境条件（如温度、湿度、光照和机械保护等）。同时说明产品的包装方式以及暴露的最差运输条件。

试剂稳定性内容的研究结果应在说明书“储存条件及有效期”中进行详细说明。

2.4 参考区间和治疗范围

对于正常未使用环孢霉素和他克莫司药物的人群样本中无可检出的环孢霉素和他克莫司及其代谢产物，因此此类试剂不涉及参考区间的内容。

治疗范围浓度取决于所采用的方法学和个体患者的临床状态，无法确定环孢霉素和他克莫司具体的治疗范围。但应当结合权威文献或研究内容说明缺少确定的治疗范围的警告性解释，并就患者差异和测试差异进行讨论。

例如：环孢霉素/他克莫司无确定的治疗范围。临床状态复杂程度、个体对于环孢霉素/他克莫司的免疫抑制和效应敏感性的差异、合并使用其他免疫抑制剂、移植物类型、移植后时间和许多其他因素导致对药物最佳血液水平的要求不同。因此，不得将个体的数值作为变更治疗方案的唯一指标，并且，在改变治疗方案前，应对每名患者进行充分的临床评估并根据临床经验来确立自己的范围。

2.5产品技术要求及检验报告

产品技术要求应按照《体外诊断试剂注册与备案管理办法》和编制要求的相关规定进行编写。同时结合产品具体适用的指导原则或相关国家标准、行业标准以及产品的特点，明确保证产品安全、有效、质量可控的各项性能指标和检验方法。

2.5.1 适用的产品标准

产品应当执行适用的强制性标准。对于强制性行业标准，若产品结构特征、技术原理、预期用途、使用方式等与强制性标准的适用范围不一致，申请人应当提出不适用强制性标准的说明，并提供经验证的证明性资料。

2.5.2 产品技术要求

2.5.2.1主要性能指标

该产品主要包括以下性能指标：试剂的外观、装量、空白限、检出限及定量限、准确度/正确度、线性区间、精密度、高剂量钩状效应、特异性、稳定性等，校准品的性状、装量（液体适用）、水分含量（如适用）、赋值结果及其不确定度的表示方式、正确度、均匀性、稳定性等，质控品的外观、装量、预期结果、均匀性、稳定性等。具体产品的性能指标需结合方法学本身特性，确定其性能指标或者提供此指标不适用的说明。

2.5.2.2检验方法

产品的检验方法应根据性能指标设定，优先采用公认的或已颁布的标准的检验方法；对于自建的检验方法，需提供相应的方法学依据及理论基础，同时应保证检验方法具有可操作性和可重现性，必要时可附相应图示进行说明，文本较大的可以附录形式提供。

2.5.3 产品检验报告

在保证产品原材料和生产工艺稳定可靠的基础上，采用在符合医疗器械质量管理体系相关要求的条件下生产的产品进行检验。有适用的国家标准品的，应当使用国家标准品对产品进行检验。可提交以下任一形式的检验报告：①申请人出具的自检报告。②委托有资质的医疗器械检验机构出具的检验报告。

如产品提交自检报告，还需按照《医疗器械注册自检管理规定》的要求提交相应资料。

3.临床评价部分

环孢霉素和他克莫司测定试剂已经列入《关于发布免于临床试验体外诊断试剂目录的通告》（国家药品监督管理局通告2021年第70号）中目录中。根据体外诊断试剂临床评价的相关要求，申请人可按照《免于临床试验的体外诊断试剂临床评价技术指导原则》（国家药品监督管理局通告2021年第74号）要求进行临床评价。

申请人也可通过临床试验的方式对产品进行临床评价，临床试验的伦理、方案的制定以及报告的撰写等临床试验资料均应符合《国家药监局 国家卫生健康委关于发布《医疗器械临床试验质量管理规范》的公告（2022年第28号）》《关于发布体外诊断试剂临床试验技术指导原则的通告》（国家药品监督管理局通告2021年第72号）对临床评价资料的规定。

下面仅对该产品临床评价中的重点问题进行阐述。

3.1 样本要求

应选择浓度覆盖线性/测量区间的预期适用人群样本和干扰样本进行研究，并注意测量区间内的各个浓度水平均应包含一定数量的样本。

样本采集方式及稳定性应符合待评价试剂和对比试剂说明书有关要求。原则上，应采用临床真实样本进行研究。当真实样本浓度无法覆盖检测范围时，应充分阐述无法获得的依据，可适当采用稀释或者经处理去除环孢霉素或他克莫司获得低浓度样本、添加环孢霉素或他克莫司获得高浓度样本等人工制备样本。人工制备样本应充分考虑样本的背景信息，基质效应等影响因素。

充分考虑不同治疗方案（移植物等）、人群选择、地域选择、年龄范围、移植后的时间和抽血时间（谷浓度及其他与给药相关的时间点等）等与给药相关的因素等内容，所采用的样本应能充分评价产品临床使用的安全性、有效性和质量可控性。

3.2 方法学比对

3.2.1 与已上市同类试剂的比对

应选择境内已经取得上市许可、目前临床普遍认为质量较好的产品作为对比试剂，同时应充分了解对比试剂的技术信息，包括临床预期用途、基本原理、性能指标等。建议企业尽量选择方法学相同、线性区间及精密度等性能接近的同类试剂作为参比试剂[7]。如免疫试验法，可利用与新器械具有相似免疫分析技术的等同器械进行比较研究。

3.2.2 与参考方法的比对

鉴于与已上市同类试剂的比对所能提供的性能信息较为有限，且抗体对待检药物/化合物的反应性不同，以及考虑到交叉反应等因素，可利用高效液相色谱法、随访信息在内的临床信息等作为参考测量程序或诊断准确度标准[7]。应根据待测化合物特性选择适宜的参考方法。

3.3统计学分析

在完成数据收集后，应先绘制散点图和差异图，对数据进行分析和审查，观察数据是否覆盖了线性/测量区间以及是否存在离群值，并初步了解待评价试剂和对比试剂测量值之间的潜在变异特征，确定如何更好地表征这些差异。

然后根据散点图和差异图判断数据是否满足相应的假设前提，并据此确定最佳的回归分析方法。常见的回归分析方法包括Deming回归、Passing-Bablok回归分析和最小二乘回归等，并对其进行假设检验以评价二者偏倚。

4.小结

本文基于现行法规和注册申报资料的要求，总结分析了环孢霉素和他克莫司检测试剂注册申报中相关技术文件的审评要点。对非临床部分的风险分析、分析性能研究、稳定性研究、参考区间研究、产品技术要求、检验报告及临床评价部分等方面作一概述，希望能够为注册申请人在环孢霉素和他克莫司检测试剂产品的研发和注册过程中提供一定的参考和帮助，同时也为医疗器械监督管理部门对注册申报资料的审评提供技术参考。