丙型肝炎流行病学临床检验技术应用的研究进展

张 平

(甘肃省天水市麦积区疾病预防控制中心，甘肃 天水 741020)

丙型肝炎在全球范围内均具有较高的发病率，丙型肝炎病毒(HCV)感染是其主要诱发因素，而HCV感染的传播途径复杂多样，除了常见的血液传播以外，HCV病毒还可能通过性接触、母婴物质交换，甚至一些综合性途径、隐性途径传播[1]。据世界卫生组织统计数据显示，不同年龄段、种族的人群均对HCV易感，每年因此类感染而死亡的人数达到35万例，其中仅有近25%的患者出现特异性症状[2]。考虑到HCV感染传播途径具有显著的复杂性，且早期症状较隐匿，早期提升丙型肝炎大面积筛查能力、推进HCV检验技术研究、完善HCV防控机制、有效控制HCV感染是全面降低丙型肝炎发病率及提升人类健康水平的有效方式。

近年来，酶联免疫吸附实验(ELISA)、荧光定量PCR等多种检验技术已在临床有所应用，采用各项技术分别从不同的角度对HCV、HCV-RNA的相关因子进行针对性检测，借助不同类型的试剂来进行HCV筛查。分析以上检验技术并发掘各项技术的优势有助于临床灵活根据HCV传播途径来合理选择筛查手段，进而实现全面防控HCV。

1 ELISA

ELISA是临床较常用的抗-HCV检测手段，其利用酶结合物与HCV抗原抗体复合物融合后产生的显色反应分析HCV阴阳性。ELISA凭借简单的操作步骤、低成本等在临床抗-HCV检验中占有一定的地位，然而不同厂家的ELISA HCV基因重级抗原质量、抗原片段比例及诊断阈值的计算方法有所不同，加之ELISA检测对变异抗原体的敏感度较低，可将其作为早期HCV感染筛查手段，避免其漏诊[3]。何小宇对100份抗-HCV试剂分别采用ELISA及Ortho公司的抗-HCV试剂(CLIA 法)进行检测发现，以上两种方法虽在诊断效能上差异无统计学意义(P>0.05)，但ELISA弱阳性(1≤S/CO值<3.8)检出率仅占20.75%，低于CLIA检测的50.98%，对单行ELISA检测者最好配合临床症状、特异性血清学检验结果进行分析[4]。

2 间接ELISA

间接ELISA检验也是临床应用度较高的一种检测方法。孙丽的研究结果显示[5]，100份抗-HCV标本依次经间接ELISA、双抗原夹心ELISA法检测的阳性检出率分别为86.08%、97.47%，差异有统计学意义(P<0.05)。间接ELISA阳性检出结果不理想或与抗-HCV ELISA试剂与血清中高免疫球蛋白G(IgG)的含量有关，抗-HCV ELISA试剂与血清中IgG结合形成少量非特异性吸附，可对HCV阳性检测结果产生干扰，应尽量在检测前稀释样本以避免血清中非特异性IgG所形成的固相吸附反应导致假阳性。

3 双抗原夹心ELISA

双抗原夹心ELISA检验技术能够弥补间接ELISA在抗-HCV检测特异性结果中的不足，双抗原夹心ELISA检测试剂可对受测者体内相关抗体给予2次特异性反应，对于减少间接ELISA检验单次特异性反应所致假阳性有积极意义。有学者就双抗原夹心ELISA与间接ELISA在抗-HCV检测中的效能进行对比后发现，双抗原夹心ELISA检测的诊断符合率、特异度分别为96.23%、98.73%，而间接ELISA检测的诊断符合率及特异度仅有86.69%、84.81%，差异有统计学意义(P<0.05)[6]；该结果不仅与双抗夹心ELISA检测对抗-HCV基因产生的2次特异性反应有关，还可能跟双抗夹心ELISA采取酶类标记抗原替代间接ELISA酶标标记二抗、对包含多种免疫球蛋白的总抗体检测有关。在以上检测技术的综合作用下，检测特异度得到显著提高，检测结果不会受非特异性免疫球蛋白反应的干扰。

4 化学发光微粒子免疫测定技术(CMIA)

CMIA检验技术的出现弥补了传统的ELISA检验技术在检验反应周期、发光信号峰值达到时间上的不足，此项技术在各类抗体、酶、脂肪酸等检测中有较高的灵敏度，其包被载体的磁性微粒面积较大。磁性微粒与项目稀释液混合后，样本中的HCV抗体可与微粒融合良好，对于加快反应样本下沉、分离效率等有积极作用；有CMIA相关研究指出[7]，与ELISA血清学监测相比，CMIA在低风险人群HCV筛查中的灵敏度达到100.00%。CMIA检测样本中HCV抗体HCV包被微粒子在激发液的作用下能够出现特异性反应，临床上根据CMIA检测中化学发光信号的呈现情况可获得特异度较高的抗-HCV含量检测结果，且CMIA不具有放射性，可保证受测者反复检验的安全性。薛海玲等就CMIA、ELISA在丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab)检测中的应用效果进行对比后发现[8]，当S/CO值≥1.0且<5.0时，处于1.0≤S/CO<2.0范围内的45例阳性标本经ELISA检测均为阴性，CMIA与ELISA检测结果符合率仅为58.33%，提示CMIA的灵敏度与ELISA检测相比优势较大，且CMIA全自动化操作、较短的反应时间、较少的干扰物作用等优势均可对HCV的定量检测产生积极影响；但CMIA仍可能受到外标本因素的影响，例如离心时间过短、合并溶血或黄疸等不良反应，或正处于HCV感染恢复期内、病原体含量过低等。CMIA作为HCV初筛手段较ELISA有更高的精准度，考虑到CMIA同样可能受到外部因素的影响，后续临床诊断过程中可适当配合高特异度血清学检验。

5 电化学发光免疫分析法(ECLIA)

常规的丙型肝炎抗体、核心抗体检测筛查窗口期最长可达2个月，ECLIA高灵敏度的优势能够协助医生迅速检测到较微量的HCV抗体。有学者对ECLIA与ELISA在HCV检测中的一致性进行分析后发现，两种检测方式在ECLIA S/CO值处于1.0～15.0范围内、ELISAS/CO值处于1.0～4.0范围内时，符合率整体偏低[9-10]。巫文勋等就化学发光免疫测定法(CLIA)、ELISA在丙型肝炎初期筛查中的应用价值进行对比后发现，CLIA检测具有较高的灵敏度，经第三方试剂验证不符的51例HBsAg标本，经CLIA法测值准确检测出49例[11]。黄燕青的研究显示，CLIA、ELISA在HCV抗体检测中与金标准PCR的Kappa一致性依次为0.898、0.832，其中的CLIA诊断优势较显著，CLIA全自动化操作将免疫反应与发光信号反应相融合，加快了标本中抗原检测的效率，同时弥补了ELISA在定量检测上的不足，对提高筛查精准度有显著作用[12]。

6 胶体金法快速试验(GICA)

胶体金是一种较为理想的免疫标记物，其检测HCV的原理为：与白磷、枸橼酸钠等还原剂相互作用后，其中所含的氯金酸能够聚合为金颗粒，并在静电环境下形成较稳定的胶体状，胶体中的负电荷能够与蛋白质分子中的正电荷基团进行良好融合，且经静电作用结合不易破坏蛋白质生物特性。王安然对GICA法、ELISA对抗-HCV特异性抗体的检验效果进行研究后发现，胶体金法能够提高检验效率[13]；胶体金高电子密度、体积小、颜色反应显著等优势为其广泛应用于细胞生物学、免疫学奠定了基础，临床利用显微镜可在胶体金法检测后观察到金标蛋白结合处的黑色颗粒聚集，迅速完成定性免疫检测。但是，GICA检测仍可能受到病毒载量、某种抑制病毒核酸扩增等因素的影响，此方法虽能缩短ELISA的检测时间，但采取GICA检测期间联合HCV-RNA检测能够弱化短时间检测中反应不充分、过滤膜破损所致检验结果模糊等不良情况的影响，进而降低检测精准度。GICA以胶体金为标志物，临床可通过分析标记物产生的层析反应检测抗原及抗体反应，借助直观操作缩短检测的耗时，这种低成本操作强化了这一检测手段在基层医院的临床应用价值；此外，GICA检测利用高电子密度特性吸引目标物质聚集，不会对受测者产生放射性同位素污染，对于扩宽GICA的应用范围有积极作用[14-15]。

7 荧光定量 PCR

荧光定量 PCR是临床低水平核酸定量检测中特异度较高的一种检测方式，能够检出丙型肝炎患者血清中低表达量的HCV-RNA，弥补传统检测方法难以明确现行、既往HCV感染的不足，同时降低生物污染率；此检测方式主要利用反应中形成的系统荧光曲线明确循环数量，通过扩增特异性HCV基因片段来测定病毒中的核苷酸序列，临床上可将其作为标准化HCV-RNA基因分型检测结果[16]。有学者就ELISA、荧光定量PCR在HCV感染诊断中的价值进行对比后发现，荧光定量PCR、ELISA检测阳性率分别为96.36%、89.09%，差异有统计学意义(P<0.05)[17]，提示荧光定量PCR在丙型肝炎诊断中的价值较显著。HCV感染需要一定的抗体产生时间，而ELISA仅在定性分析上有一定效用；荧光定量PCR能够利用自身定量分析的优势明确受测者体内HCV-RNA含量，直观地显示受测者的HCV水平，同时能够反映出治疗期间抗病毒药物杀灭HCV病原体的效果[18]。

8 结语

丙型肝炎早期症状的隐匿性决定了丙肝患者需要借助客观、高特异性手段来明确诊断，ELISA、CMIA、ECLIA、GICA、荧光定量PCR等检测手段分别在检测耗时、操作方式、特异度等方面各具优缺点。后续工作中应继续深入研究各种检测手段的特性，建立更加完善的HCV流行病学检测方案，推动HCV核酸定量、基因分析检测技术的广泛应用，灵活联用以上检测技术，在最佳窗口期内最大程度地减少误诊、漏诊。