牛病毒性腹泻-粘膜病实验室诊断技术

陈智丽

（南京市溧水区永阳街道畜牧兽医站，江苏 南京 211200）

牛病毒性腹泻-粘膜病需要采用实验室检测对病毒进行识别，为病毒诊断提供有效依据。随着对牛病毒性腹泻-粘膜病诊断技术的深入研究，已经建立了多种诊断牛病毒性腹泻粘膜病的诊断方法，本文将主要的方法介绍如下，供参考和选择。

1 临床表现

牛病毒性腹泻-粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒感染引起，对牛具有较大的危害，该病的潜伏期7～10d。该病的临床症状比较明显可分急性和慢性两种。（1）急性病症 潜伏期一般在1周左右，病牛将出现持续高烧、精神不振等症状。严重时，将会引发腹泻，致使牛体内水分流失，使其体温升高，进而引发牛的死亡。（2）慢性病症 病牛的体温长期偏高，临床表现不如急性腹泻剧烈，但同样会对牛造成较大影响。而且，牛的眼角、鼻腔会出现大量的分泌物，导致牛逐渐消瘦，使其失去健康的体征。该病后期，病牛会极度消瘦，黏膜会出现大量的充血，肠道伴有粘液、气泡等，导致牛无法正常采食，使其逐渐衰弱而死亡。所以，需要做好该病的防治工作，避免该病的发生和流行，应结合实验室诊断的方式，使病变能够得到及早预防，降低粘膜病对牛的影响。

2 实验室诊断技术

2.1 免疫过氧化物酶技术该技术具有较强的可靠性，诊断结果较为准确。采用该技术检测时，需要对BVD-MDV抗原进行检测，对其分布状况进行确定，对抗原，需要采用过氧化物酶进行处理，制作组织切片，抗原将固定在组织中，确保抗原检测精确度。切片需要采用0.02%蛋白酶进行处理，在4℃环境下，对切片进行消化处理，提高切片对酶的亲和度。牛病毒性腹泻—粘膜病属于持续性的病毒血症，对组织的影响较为严重，对病毒抗原应进行严格检测，提高病原检测技术的有效性。对BVD-MDV可以采用间接鉴定形式，通过过氧化物酶对切片的着色检查，借由免疫荧光法进行检验，进而可以通过显微镜进行观察，确保染色后的细胞能够肉眼可见。

2.2 蛋白A胶体金免疫电镜技术电镜检查是病毒诊断的重要方式，能够实现病毒粒子的检测，对病毒粒子进行敏感识别。电镜技术对病毒粒子数量具有一定的要求，需要控制在107个/mL，保证病毒能够通过电镜进行识别。电镜技术需要采用高速离心操作，对病毒液进行浓缩处理，以降低对病毒鉴定的难度。电镜具有较高的检测密度，可以在低倍数的情况下进行检查，使病毒检测便具可靠性，提高对病毒的识别能力。在蛋白A胶体金免疫的作用下，实现对抗原-抗体复合物的识别，使其形成抗体桥的形式，使金颗粒能够分布在抗桥的周围，确保病毒构造的清晰程度。该诊断技术检测过程较为迅速，对病毒的识别较为敏感，在诊断时间方面，仅用3～4h便可完成检验。电镜技术可对病毒的特征进行识别，对病毒囊膜上的纤突进行确定，检测具有较高的敏感性。

2.3 核酸杂交技术核酸杂交技术是较为新颖的诊断技术，并且实验要求较高。核酸杂交可以对病变细胞进行识别，通常采用基因探针识别的方式，对病变细胞的基因序列进行检验。核酸杂交技术具有较强的敏感性，属于基因检测范畴，要重视探针的使用方法，提高探针的应用水平。应用该技术时，需要采用杂交方式进行诊断，通过对杂交率进行分析，对病毒对细胞的感染情况进行判断。基因探针具有较强的针对性，其诊断精度很高，诊断过程中具有较高的检出率。核酸杂交技术的难点在于对探针的制作，需要以病毒核酸作为制作探针的依据，确保探针能够对病源进行精准识别，保证杂家技术应用的合理性。

2.4 聚合酶链反应技术该技术具有较高的敏感性、特异性，操作比较方便，适用于对病变细胞的检测。聚合酶链反应需要对引物进行DNA的序列层面扩增，同时需要在正常细胞中培养，将病变细胞与其进行对比，使病毒的检测更加的标准化。在聚合酶的作用下，可以对病毒进行反转录，提高病毒检测的敏感性。检测过程中，敏感度的临界值为半数组织培养感染量，能缩短诊断时间，提高细胞检测的有效性。聚合酶链反应属于基因层面的检测，一般采用特异性引物，提高DNA序列的转录效率，保障病毒诊断能够顺利进行。

2.5 病毒分离鉴定技术病毒分离鉴定技术是指在血清中分离病毒，并对其进行鉴定，进而诊断疾病的技术，此种技术应用较为成熟，属于病原鉴定的重要技术手段之一。在技术应用的过程中，需要对接种细胞进行培养，同时对细胞的病变情况。在实验过程中，要采集病牛病料并分离病毒，接种到健康细胞中，经过细胞传代，分析病毒感染情况。为了确保病毒的分离效果，需要将病原接种到MDBK细胞中，经过培养和传代可发现细胞病变，经过检定后发现细胞呈现阳性，进而证明病毒为牛病毒性腹泻病毒。病毒分离鉴定诊断是一种间接诊断方式，在外部对接种细胞进行培养，需要消耗一定数量的时间。患病早期病牛没有临床表现，需要采用病原进行外部培养，以提高对病毒的诊断效率。病毒分离鉴定可通过细胞培养提高病原的数量，以提高整顿的精准性。

2.6 血清抗体检测技术血清抗体检测技术，是指采集液制备血清，对血清中的病毒抗体进行检测，根据检测结果诊断疾病的技术。诊断过程中，应当首先要进行人工感染，将病原注入到动物体内，使其对体内细胞进行感染，使病原能够得到外部检验。通常，选择小健康小白鼠进行试验，将病料对小白鼠进行接种。（1）可将5mL病原上清液静脉注射到小白鼠体后正常饲养。（2）将2mL病原上清液由鼻腔滴入。接种后需要对小白鼠的临床表现进行观察，确定病原对小白鼠健康状况的影响。同时，还要对小白鼠进行病毒分离及血清抗体检测，对病原进行进一步的诊断，确定病原是否在其体内存活，若存活则牛病毒性腹泻病毒进行诊断，确定是否由该病原引起小白鼠患病。

2.7 电镜技术电镜技术又称电子显微镜技术，属于细胞生物学研究手段之一，可对细胞亚显微结构和病毒进行观察，从而达到诊断疾病的目的。检测前需要对病原进行培养，使病毒能够达到一定的数量，确保电镜下能够对病毒进行识别。电镜检验需要对病料进行处理，将病料制成超薄切片形式，采用电镜确定病毒粒子的形态，对病毒的体征进行判断。但病毒粒子的数量需要控制在10-6/mL以上，才能符合电镜观察的要求。同时，可对病原进行细胞培养，将病料接种到MDBK细胞中，将其繁衍10代左右。采用电镜技术观察细胞培养物，对牛病毒性腹泻病毒进行检验。可见到病毒离子呈现圆形、有囊膜、有突起等特征，直径在40～60nm。

2.8 特异性抗体检测技术特异性抗体技术主要指中和实验，通过对细胞的定性检验，实现对疾病的诊断。可将牛病毒性腹泻病毒接种在睾丸细胞或犊牛肾细胞中，并进行细胞形态观察。经过2～3周后，采用被检血清与接种细胞稀释液进行混合，若检测结果为阳性，则说明有牛病毒性腹泻病毒存在。中和实验诊断方式具有较高的检出率，便于进行定性、定量检验，属于常用的实验室检测方式。中和实验诊断是病毒或毒素与相应抗体结合后，失去对易感动物的致病力和试验方法，该法敏感性强特异性高使用范围广。可定性检测，也可定量检测。

2.9 琼脂扩散技术琼脂扩散技术原理简单，但仅能够实现粗略检验，检出率难以达到精准的水平，此项技术的优势在于能够对其它诊断结果进行佐证，常用于对其它诊断方式进行验证。在使用该诊断技术时，需要以病变组织作为实验部位，将其与阳性血清混合进行琼脂扩散。在实验过程中，血清滴度应控制为1:2，将血清分为若干份进行实验，这样可以提高检测结果的精度，促进琼脂扩散实验检出率的提升。琼脂扩散诊断成本较低，检验过程较为快速，是牛病毒性腹泻病毒诊断的重要方式。琼脂扩散实验的检出率在70%～80%，检出率受到病原数量的影响，一旦检测出病原且结果为阳性，则说明病变部位存在牛病毒性腹泻病毒，需要做好该病的应对工作。

2.10 免疫荧光技术免疫荧光技术是科研机构实验室中的重要诊断方式，检测前，需要对病毒粒子进行培养，采用荧光法对其进行标记，使病毒粒子能够以荧光的形式呈显，便于对病毒进行鉴定。在试验过程中，需要以病牛血清作为实验材料，采用荧光法对抗体进行标记，使得诊断技术具有较高的特异性，可以增强对病毒的识别效率，使检出率能够达到98%以上。免疫荧光技术敏感性较高，对病毒的检测速率较快，在需要快速得出诊断结果的情况下，采用该诊断技术较为适宜。然而，该诊断技术的缺点是无法对非特异性病原进行检测。

2.11 酶联免疫吸附技术酶联免疫吸附技术要求对抗原以及抗体进行固化，在此基础上，加入其它物质，形成抗原抗体复合物，通过检测，可产生有色产物，通过定量分析诊断疾病。在技术应用的过程中，需要严格做好病毒分离操作，提高病毒诊断的效率。在病毒分离检测过程中，采用多样本检测的方式，取400份牛血清样品进行实验，对血清采用检验手段。其中，182份血清呈现阳性，218份血清呈现阴性。酶联免疫吸附试验是重要的诊断形式，可以对血清样品进行检验，并且不需要较高纯度的抗原，可以缩短病原的培养时间，提高对病原的检测效率。利用酶联免疫吸附试验原理，能够实现试纸的检测形式，使病原诊断的操作更加方便。酶联免疫吸附试验对抗体检测具有较高的灵敏度，在室温下便可以进行实验，便于将诊断技术进行推广。该法具有快速、敏感性高、操作简便、易于标准化等优点，适合推广使用。

2.12 分子生物学诊断技术分子生物学诊断技术要求以DNA以及RNA作为诊断用材料，通过相应的检测技术观察待检测样本中是否存在基因异常表达的情况，从而达到诊断疾病的密度。在分子生物学诊断技术应用的过程中，需要应用到反转录PCR，通过DNA的不同对病毒进行区分，以作为牛病毒性腹泻病毒的诊断依据。分子生物学诊断需要注重机体的选择，使机体具有良好耐受特征，确保病毒能够快速地完成转录工作，确保病毒对细胞的感染能力。在分子生物学方面，具有完善的核酸检测手段，可以通过探针来对牛病毒性腹泻病毒的核酸进行检验，对特定的基因序列进行识别，对病毒实施精准化对检验。为了提高病毒检测的精度，可以采用RT-PTR技术进行诊断，并且与荧光定量技术相结合，对检测到的基因序列进行标记，进而实现感染细胞的荧光检验。另外，需要对抗原捕获ELISA技术进行应用，提高病毒检测的灵敏度，可以将灵敏度提升10倍以上，根据病毒的特异性进行诊断，丰富对牛病毒性腹泻的临床诊断经验。

3 结论

牛病毒性腹泻—粘膜病是常见的牛病，需要注重实验室诊断技术的应用，通过病原诊断、血清学诊断、分子生物等方面的应用，使腹泻病原得到全面地检测，确保诊断过程更加科学合理，提高了对病毒识别的有效性。实验室诊断是诊断牛病的重要技术，需要严格按照实验过程进行分析，提高对腹泻病毒的诊断能力，保障牛病毒性腹泻的诊断技术更加充分。