ALKBH5调控AXL mRNA去甲基化促进卵巢癌细胞化疗耐药性

吴世丽，张 燕，许 莉

(海口市妇幼保健院妇产科，海口 570102)

卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤，2020年全球女性新发卵巢癌31万例，中国6万例，全球女性癌症死亡卵巢癌患者21万例，中国卵巢癌患者死亡人数4万例[1-2]。目前手术和化疗是卵巢癌最主要的治疗手段，然而因肿瘤细胞对化疗药物产生耐药，约60%的卵巢癌患者出现复发，总体疗效不好。AXL是受体酪氨酸激酶TAM(Tyro3、Axl、Mertk)家族中的一员，在多种类型肿瘤细胞中表达上调，其高表达与化疗耐药及不良预后相关，常作为预测肿瘤预后的生物标志物和抗肿瘤治疗的靶点[3]。目前关于AXL的调控存在很多未知。如RMVar数据库显示，AXL mRNA存在多个N6-甲基腺苷(m6A)位点，而这些不同位点的功能以及整体的mRNA甲基化水平变化对于AXL的基因转录及其功能的影响目前尚未见报道。m6A修饰是近年来生命科学领域的研究热点，m6A修饰是类似于DNA和组蛋白修饰的另一种表观遗传调控，由甲基转移酶复合体(Writers)、脱甲基酶(Erasers)和功能管理者(Readers)组成[4]。ALKB同源物5(ALKBH5)是目前已知的两种m6A去甲基化酶之一，在肿瘤疾病进展恶化方面具有重要的调控作用。最近，ALKBH5对许多生物学过程的影响已得到证实，包括肿瘤的增殖、侵袭、转移、骨化等[5-7]。ALKBH5还涉及多种癌症或非癌症，如胶质母细胞瘤、胰腺癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌、糖尿病和生殖系统疾病。本文探讨了ALKBH5调控AXL mRNA甲基化水平进而影响卵巢癌紫杉醇耐药的作用机制，为临床化疗治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 卵巢癌细胞SKOV3购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。细胞复苏后培养于MEM+10%FBS+100U/mL青霉素(100μg/mL链霉素)置37℃、5%CO2培养箱常规培养。总RNA提取试剂(北京全式金生物)；反转录试剂盒(北京全式金生物)，GenSeq®m6A MeRIP试剂盒(云序生物)，SYBR染料法荧光定量试剂盒(TaKaRa)；RIPA裂解液(Solarbio，R0010),Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒(BioLegend)。actinomycin D(Sigma)免疫印迹一抗：ALKBH5抗体(Abcam)，AXL抗体(Abcam)，GAPDH抗体(Abcam)，二抗：HRP标记的山羊抗兔IgG[天德悦(北京)生物]。ALKBH5过表达(NM_017758.4的CDS区序列)慢病毒、ALKBH5干扰(5'-TATGCTGCTGATGAAATCAC-3')慢病毒、AXL过表达(NM_001278599.2的CDS区序列)慢病毒和AXL干扰(5'-ATGCTGAATGAGAACATGTCC-3')慢病毒由苏州吉玛基因公司制备。病毒滴度2×108TU/mL。

1.2 慢病毒感染SKOV-3细胞 SKOV3细胞传代于6孔板培养18h，换新鲜不含血清的MEM培养液，取1μL制备好的sh-ALKBH5慢病毒或sh-AXL慢病毒和1μL polybrene(2μg/mL)加入培养皿，将细胞置于37℃、5% CO2培养箱培养24h，更换新鲜培养液，继续培养进行后续实验。SKOV3的MOI值为20pfu/cell，荧光显微镜下观察72h的感染效率约为80%。sh-ALKBH5为ALKBH5基因干扰，NC-sh为对照干扰载体；OE-ALKBH5为ALKBH5基因过表达，NC-OE为对照空载体。

1.3 CCK-8法测定细胞增殖 按5×103细胞/孔接种至96孔培养板，置CO2培养箱培养，24h后进行sh-ALKBH5慢病毒(或NC)感染，分别加慢病毒0、24、48、72h，每孔加CCK-8溶液10μL，将培养板置培养箱继续孵育2h，用酶标仪测定450nm波长处吸光度值。每组设置6个重复孔，绘制细胞增殖曲线。

1.4 RNA稳定性试验 ALKBH5作为脱甲基酶，能针对mRNA上的甲基化修饰发挥作用，精细调节mRNA的翻译。为了研究其对mRNA的调控作用，利用放线菌素D(Actinomycin D)对RNA转录的抑制作用，进行mRNA稳定性试验。ALKBH5干扰后48h,加放线菌素D(5μg/mL)处理细胞2、4、6h，收集细胞，Q-PCR检测AXL mRNA。总RNA提取采用TRIzol一步法，取2μg总RNA反转录为cDNA。以GAPDH为内参(引物序列见表1，F：正向引物；R：反向引物)，按SYBR Green实时PCR试剂盒说明书配制总体积为20μL的PCR反应体系。PCR热循环参数：95℃、5min预变性;94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环;72℃延伸10min。检测结果采用2-ΔΔCt法计算。

表1 PCR引物序列

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将NC和sh-ALKBH5感染细胞分别接种于6孔板，48h后分别给予紫杉醇(paclitaxel,10μmol/L)或CHX(5μg/mL)，培养24h，收集细胞并用PBS冲洗2次。将细胞重悬于500μL预冷的1×结合缓冲液，加5μL Annexin-V-FITC混合均匀，室温避光孵育15min，加2.5μL PI染色液避光5min，独立重复3次实验。流式细胞仪检测细胞凋亡率，采用FlowJo软件进行数据分析。

1.6 Western blot 细胞加入预冷的RIPA裂解液裂解，超声破碎；4℃ 12000r/min离心10min收上清。BCA法蛋白定量，加5XSDS上样缓冲液，97℃加热6min使蛋白变性。蛋白样品(30μg/孔)点样，进行SDS-PAGE电泳。分离胶浓度10%，跑胶结束后，转膜，封闭，加一抗。ALKBH5与AXL一抗稀释比例1∶1000，GAPDH稀释比例1∶10000。4℃一抗孵育过夜。次日TBST洗膜3次，每次5min。加1∶5000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG二抗，室温孵育1h，TBST洗膜。加ECL化学发光液，置ChemiScope Mini 3300化学发光成像仪中拍照，使用Quantity One软件分析灰度水平。

1.7 AXL m6A甲基化水平检测 收集过表达或敲低ALKBH5的细胞，利用RNA提取试剂盒提取total RNA，按GenSeq®m6A MeRIP试剂盒说明书进行。具体步骤：(1)总RNA提取和定量后，取100μg总RNA进行RNA片段化，留1～3μg片段化的RNA作为对照input组，剩余的片段化RNA均用于后续免疫沉淀实验；(2)偶联有m6A抗体的免疫沉淀磁珠预处理，将片段化的RNA加至磁珠中，进行免疫沉淀2h，4℃；(3)沉淀后的RNA用清洗buffer进行纯化；使用纯化后的RNA可采用常规的qPCR法进行目的基因定量。

1.8 免疫共沉淀(CO-IP)检测ALKBH5与AXL相互作用 sh-ALKBH5慢病毒感染SKOV3细胞株，0、48、72h后收集细胞沉淀。细胞加预冷的RIPA裂解液裂解，超声破碎；4℃，12000r/min离心10min收上清。BCA法蛋白定量，取上清200μg总蛋白加5×SDS上样缓冲液，97℃加热6min使蛋白变性，留作input。剩余细胞裂解液上清取1mg总蛋白加入10μg AXL抗体，4℃慢速震荡，孵育过夜。次日取10μL protein(A+G)琼脂糖珠加至上述过夜孵育的混合液，4℃慢速震荡孵育2～4h，使琼脂糖珠与抗体复合物充分耦联。洗涤缓冲液洗抗体-琼脂糖珠混合物5次，离心将琼脂糖珠离心至管底，弃上清，沉淀中加15μL 2×SDS上样缓冲液，97℃加热变性6min。Western blot法检测ALKBH5(44kDa)与AXL(98kDa)的相互作用。

1.9 统计学处理 采用SPSS 18.0统计软件，两组间比较使用成对分析(t-test)，多组间比较满足方差齐性时采用F检验进行单因素方差分析，观察的变量整体方差不齐时采用矫正的单因素方差分析。组间两两比较采用ONE-WAY ANOVA中L-S-D法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ALKBH5在卵巢癌组织中的表达及临床生存分析 CPTAC数据库分析结果显示，癌组织中ALKBH5蛋白表达水平显著高于正常对照组织(P<0.05)(图1A)。Kaplan-Meier生存分析结果发现，ALKBH5高表达患者的生存率低于ALKBH5低表达患者(P<0.001,HR=1.43)(图1B)。

2.2 ALKBH5干扰对卵巢癌细胞增殖的影响 荧光定量PCR检测和Western blot结果显示，sh-ALKBH5组细胞株ALKBH5 mRNA和蛋白表达水平均低于对照细胞株(P<0.05)；OE-ALKBH5组细胞株ALKBH 5mRNA和蛋白表达水平均高于NC-OE组(P<0.01)(图2A～C)。细胞平板克隆实验结果显示，sh-ALKBH5组的卵巢癌细胞克隆数明显低于NC-sh组，OE-ALKBH5组的细胞克隆数明显高于NC-OE组(图2D)。CCK-8检测结果显示，ALKBH5敲低后细胞增殖能力显著低于NC对照细胞株，ALKBH5过表达则促进了细胞增殖(P<0.01)(图2E、F)。细胞划痕结果显示，ALKBH5敲低后卵巢癌细胞迁移率与NC-sh组相比显著升高，ALKBH5过表达后卵巢癌细胞迁移率与NC-OE组相比显著下降(P<0.05)(图2G)。

2.3 干扰ALKBH5促进卵巢癌细胞凋亡和降低细胞耐药性 流式细胞术检测结果显示，ALKBH5干扰后增加细胞凋亡(P<0.05)，ALKBH5过表达抑制细胞凋亡(P<0.05)。紫杉醇处理后，sh-ALKBH5细胞凋亡率显著高于NC-sh组(P<0.05),OE-ALKBH5细胞凋亡率显著低于NC-OE组(P<0.05)(图3A、B)。CCK-8结果显示，紫杉醇(5μmol/L)处理后，OE-ALKBH5细胞增殖能力高于对照细胞株，而sh-ALKBH5细胞增殖能力低于对照细胞株(图3C)。紫杉醇处理细胞后，ALKBH5干扰细胞的IC50与对照NC细胞的IC50相比约降低41.4%，过表达细胞株约增加39.9%(图3D)。

2.4 ALKBH5调控AXL mRNA甲基化水平 gepia2.cancer网站分析结果显示，ALKBH5与AXL存在相关性(图4A)。SKOV3细胞中，ALKBH5过表达或敲低后，AXL上调(P<0.001)或下调(P<0.05)(图4B)。ALKBH5敲低后，随着时间延长，AXL依赖性降低(图4C、D)。利用m6A抗体免疫共沉淀检测富集到的甲基化AXL mRNA，结果显示ALKBH5敲低，富集到的AXL m6A水平显著下调(P<0.01)，而ALBH5过表达富集到的AXL m6A水平显著上调(P<0.01)(图4E)。免疫共沉淀蛋白水平上富集到的两者之间不存在相互作用的现象(图4F)。利用RMVar数据库分析发现AXL mRNA上存在多个m6A位点(表2)。

图1 ALKBH5蛋白在卵巢癌中的表达及其与生存率的相关性

表2 AXL mRNA上m6A位点

图2 ALKBH5干扰对卵巢癌细胞增殖和迁移的影响

图3 ALKBH5过表达或敲低对SKOV-3细胞凋亡和耐药性的影响

图4 ALKBH5表达与AXL m6A甲基化水平的相关性

2.5 ALKBH5增加AXL mRNA稳定性、抑制细胞凋亡和药物敏感性 放线菌素D(Actinomycin D)处理SKOV3细胞，AXL mRNA水平随时间逐渐减少，半衰期为5.136h；同样条件下，处理ALKBH5干扰细胞株，AXL mRNA半衰期为3.311,明显低于对照细胞(图5A)。放线菌素D处理shALKBH5细胞，AXL蛋白表达水平明显低于对照细胞株(图5B、C)。流式结果显示，Actinomycin D处理4h后，ALKBH5敲低细胞凋亡明显高于未敲低细胞(图5D、E)。在SKOV3细胞上敲低AXL，AXL干扰细胞株对紫杉醇的敏感性增加，过表达ALKBH5则逆转了AXL敲低细胞的IC50(图5F)。ALKBH5过表达，稳定了AXL mRNA，抑制了对紫杉醇的药物敏感性。

图5 ALKBH5对AXL mRNA稳定性的影响

3 讨 论

遗传信息由DNA复制到RNA转录以及翻译为蛋白质的过程中，遗传物质会进行多种编辑、调节和修饰。目前研究发现，除了DNA甲基化修饰外，还存在多种RNA修饰，如常见的RNA甲基化修饰包括有6-甲基腺嘌呤(m6A)、5-羟甲基胞嘧啶(hm5C)、假尿嘧啶(Ψ)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、1-甲基腺嘌呤(m1A)等,在细胞内进行生物功能调控[8]。m6A是目前研究较多、也是mRNA中丰度最高的甲基化修饰形式，其生物学功能主要通过m6A结合蛋白发挥RNA转录后调控作用。m6A修饰主要由甲基转移酶(编码器)、去甲基化酶(消码器)和结合蛋白(读码器)共同调控，目前已发现FTO和ALKBH5作为去甲基化酶可去除甲基化，而METTL3、METTL14、WTAP和KIAA1429等作为甲基转移酶复合物的主要成分发挥作用[9]。

在肿瘤中，ALKBH5的生物学功能表现出多样性，可作为促癌因子和抑癌因子同时存在。研究发现，m6A脱甲基酶ALKBH5在成胶质细胞瘤干样细胞(GSCs)中表达显著升高。沉默ALKBH5可抑制患者来源的GSC的增殖和自我更新。ALKBH5使FOXM1新生的转录本脱甲基，导致FOXM1表达增强，进而影响胶质母细胞瘤的病理进程[10]。乳腺癌中，肿瘤细胞暴露于缺氧环境会刺激缺氧诱导因子(HIF)-1α和HIF-2α依赖的AlkB同源物5(ALKBH5)表达。在NANOG的3'-UTR的m6A残基处，缺氧以HIF和ALKBH5依赖性方式诱导了NANOG mRNA和蛋白表达的增加，并增加了乳腺癌干细胞(BCSC)百分比[11]。作为抑癌因子，ALKBH5在胰腺癌组织中表达显著降低，与患者生存率相关，是判断胰腺癌预后的独立标志物[12]。ALKBH5靶向lncRNA KCNK15-AS1使其去甲基化，也可靶向Wnt信号通路抑制因子WIF-1，抑制胰腺癌细胞迁移和侵袭[13-14]。

本研究通过对CPTAC数据库中卵巢癌的数据分析发现，与正常组织相比，卵巢癌组织中ALKBH5高表达，且与总生存期相关。猜测ALKBH5可能起促癌因子的作用。同时在临床治疗中，卵巢癌患者普遍出现耐药的现象，推测ALKBH5与卵巢癌化疗耐药之间可能存在相关性。当敲低ALKBH5后，卵巢癌细胞增殖明显受到抑制，细胞凋亡率增加，对紫杉醇敏感性增加，IC50降低约53%。提示ALKBH5与化疗耐药性存在相关性。进一步对卵巢癌中与ALKBH5相关尤其是与耐药相关的蛋白分析，发现ALKBH5与AXL具有相关性。

AXL属于受体酪氨酸激酶中的TAM(TYRO3-AXL-MER)家族,在肿瘤耐药中起重要作用，如在泌尿上皮癌、乳腺癌、卵巢癌等多种癌症中高表达，并介导上皮间质转化的发生[15]。AXL可通过维持同一途径替代效应子的活性或通过诱导不同信号网络的激活导致对靶向药物的耐药性，尤其是对其他RTK抑制剂的耐药性[16-17]。如在非小细胞肺癌中，AXL表达维持PI3K/AKT和MEK/ERK信号传导，从而介导对EGFR抑制的抵抗。此外，AXL可通过调节信号通路及影响肿瘤微环境等促进靶向治疗耐药的产生。本研究发现，卵巢癌中ALKBH5与AXL呈正相关，敲低ALKBH5后，AXL mRNA表达水平依赖性降低。鉴于AXL属于激酶家族成员，用免疫共沉淀法探究蛋白水平上的相互作用，结果显示两者蛋白水平上不存在相互作用，ALKBH5可能是在AXL转录水平上进行调控。进一步利用RMVar数据库分析发现，AXL上存在多个m6A位点，推测ALKBH5通过作用于AXL mRNA上的m6A调控AXL mRNA表达。RNA稳定性试验结果显示，ALKBH5干扰下调了AXL mRNA半衰期，提示可能由于AXL mRNA上m6A甲基化水平增加促进了基因降解；过表达ALKBH5使AXLmRNA上m6A甲基化水平降低抑制AXL mRNA降解，进而促进AXL蛋白表达。AXL敲低后，细胞凋亡和对紫杉醇的敏感性增加，验证了AXL的耐药功能。以上结果提示，ALKBH5高表达具有稳定AXL mRNA的功能，进而增加了细胞对紫杉醇的耐药性。然而AXL mRNA上具体的m6A修饰位点的功能，如肿瘤细胞中因m6A修饰而逃避被降解的内在机制有待后续研究。目前没有脱甲基酶ALKNH5的特异性抑制剂，无法进一步证实ALKBH5对AXL的去甲基作用，因而新型抑制剂的开发及临床应用亟需深入研究。

综上所述，m6A去甲基化酶ALKBH5在卵巢癌中高表达，具有稳定耐药基因AXL的功能，可作为化疗耐药的预测因子，开发新型ALKBH5抑制剂具有重要的临床意义。