新型冠状病毒非结构蛋白14的表达及酶活性分析

陈 双，徐婧雯，丁开云，刘建生，彭小忠,3，刘红旗*

1.昆明医科大学 基础医学院 免疫学系，云南 昆明 650500；2.中国医学科学院 北京协和医学院 医学生物学研究所，云南 昆明 650118；3.中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 生物化学与分子生物学系，北京 100005

新型冠状(新冠)病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2/2019 novel coronavirus, SARS-CoV-2/2019-nCoV)属于β属冠状病毒，是一种具有包膜的单股正链RNA病毒[1]。SARS-CoV-2的暴发给全球公共卫生与健康带来了巨大的威胁(https://covid19.who.int/)。因此，严格预防和控制SARS-CoV-2的感染与流行是全球亟待解决的事情。病毒进入宿主细胞后，基因组的开放阅读框1a/b在胞质内翻译并合成十几个非结构蛋白(non-structure proteins, Nsps)，nsps组成病毒基因组复制所必需的复制-转录复合体[2]。其中nsp14是复制-转录复合体的组成部分之一，在病毒基因组复制过程中具备3′-5′核酸外切酶活性和鸟嘌呤N7-甲基转移酶活性，发挥双重酶活性功能，分别维持病毒基因组高保真性复制和参与mRNA的加帽修饰过程[3-4]。除了以上功能外，多项研究发现SARS-CoV-2 Nsp14在抑制宿主细胞蛋白质翻译[5]和调控宿主细胞NF-κB信号通路[6]等过程具有重要的作用。此外，Nsp14还在减毒灭活疫苗的研发中展现出较好的潜力[7]。因此，Nsp14在维持子代病毒正常扩增所发挥的重要功能使其成为了抗病毒治疗药物研发的潜在靶点。本研究通过原核表达系统成功地表达并纯化出具有酶活性的SARS-CoV-2 Nsp14，为靶向Nsp14的抗病毒治疗药物的筛选提供有利的条件。

1 材料与方法

1.1 材料

pET-30a(+)和pGEX-6P-1质粒(本实验室保存)；大肠杆菌密码子偏好性优化后的SARS-CoV-2原始株nsp14序列(Genewiz公司)，保存于pET-30a(+)质粒中，命名为pET30a-linker-OPTI-Nsp14。linker-sumo序列保存于pUC57质粒中，命名为pUC57-linker-sumo(Sangon公司)；大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5α和BL21(DE3)感受态细胞(Angyubio公司)；限制性内切酶和T4 DNA连接酶(NEB公司)；In-Fusion HD Cloning Kit、PrimeSTAR®Max DNA Polymerase和RNase A核酸酶(TaKaRa公司)；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(Tiangen公司)；溶菌酶(Solarbio公司)；谷胱甘肽高速层析介质(4FF)预装柱(Biodragon公司)；Superdex200 Increase 10/300GL 层析柱(GE公司)。

1.2 方法

1.2.1 序列分析和引物设计：利用MEGA7软件分析SARS-CoV-2原始株nsp14的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列。设计质粒的引物如表1所示。

1.2.2 重组表达质粒的构建与鉴定：使用表1的引物和限制性内切酶获取目的基因和线性化的载体。目的片段经纯化后连接，连接产物转化E.coliDH5α细胞，接种于氨苄抗性(Amp:100 μg/mL)或卡那抗性(Kana:50 μg/mL)的LB平板上培养过夜。挑取多个单克隆菌落至培养基中振荡培养，取1 μL菌液作为模板进行PCR扩增。经PCR鉴定阳性的菌液提取其质粒，再进行质粒双酶切(37 ℃，1 h)，酶切的产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。双酶切鉴定正确的质粒送Sangon公司进行DNA测序鉴定。

1.2.3 目的蛋白的可溶性表达与鉴定：将表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)细胞。挑取单克隆菌落至培养基中培养过夜，取5 mL菌液转接至250 mL培养基中，于37 ℃、220 r/min摇床中培养至菌液的A600值为0.4～0.6，随后将菌液温度降至20 ℃，再加入IPTG(0.5 mmol/L)诱导表达16 h。离心(4 ℃，10 000×g)收集菌体后用25 mL超声缓冲液重悬菌体沉淀，于冰水浴中超声(40% 功率，超声5 s，停顿10 s，超声1 h)，超声后离心30 min分离上清液和沉淀(4 ℃，18 000×g)，再用等体积的超声缓冲液重悬沉淀。取等体积的表达产物进行SDS-PAGE，利用考马斯亮蓝染色和Western blot(His-tag/GST-tag抗体)验证目的蛋白质的表达量。用ExPASy Prot Param tool 计算表达产物的分子大小。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.2.4 pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14表达温度的优化：按照1.2.3步骤准备250 mLE.coliBL21(DE3)表达菌液，分别在37、30、20和13 ℃诱导表达。按照谷胱甘肽亲和柱的说明书纯化超声上清液，用洗脱缓冲液(40 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，150 mmol/L NaCl，5 %甘油(v/v)，0.5 mmol/L PMSF，20 mmol/L还原型谷胱甘肽)进行洗脱。洗脱液用10 ku超滤管浓缩至2 mL。取上清液和洗脱液进行SDS-PAGE，利用考马斯亮蓝染色验证蛋白质表达量。

1.2.5 pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14表达产物的纯化：准备1LE.coliBL21 (DE3)表达菌液，离心(4 ℃，10 000×g)收集菌体后用50 mL超声缓冲液重悬，超声液中加入溶菌酶(500 μg/mL)，于4 ℃缓慢振荡0.5 h后进行超声(40%功率，超声15 s，停顿30 s，超声90 s)和亲和纯化。将洗脱液的缓冲液更换为保存缓冲液(25 mmol/L HEPES pH 7.5，150 mmol/L NaCl，5%甘油(v/v)，0.5 mmol/L PMSF)，测定其总蛋白量后，每100 mg蛋白质加入1 mg 3C蛋白酶(本实验室制备)，于4 ℃缓慢振荡16 h。酶切液经亲和纯化后收集流穿液，再用分子筛柱进行纯化，最终得到不含标签的Nsp14(-80 ℃保存)，用已知浓度的BSA标准品，通过灰度分析测定其蛋白质浓度。

1.2.6 非结构蛋白14(Hsp14)核酸酶活性的分析：dsRNA序列(Oligo ii+ Oligo iii)见参考文献[8]，用无酶水将dsRNA稀释至0.5 μmol/L。用反应缓冲液(25 mmol/L HEPES pH 7.5，20 mmol/L NaCl，0.02% Tween-20，5% 甘油，5 mmol/L MgCl2，0.1 mg/mL BSA，0.5 mmol/L PMSF，2 mmol/L DDT)配制反应体系(20 μL)：1)2 μL dsRNA(0.5 μmol/L)；2)Nsp14终浓度为0、50、75、100、200、250、500和1 000 nmol/L；3)反应缓冲液补充至20 μL。RNase A(1 g/L)作为对照替代Nsp14组分，其余组分不变。反应体系于37 ℃水浴锅中孵育45 min后加入20 μL终止液(98%甲酰胺，10 mmol/L EDTA)，于95 ℃变性2 min后冰上放置。取20 μL反应物进行尿素(7 mol/L)聚丙烯酰胺凝胶电泳(180 V电泳1.5 h)。电泳结束后，利用Odyssey红外激光扫描程序系统对凝胶进行扫描(激发波长：700 nm)。

2 结果

2.1 Nsp14氨基酸序列和核苷酸序列的分析

分析发现，SARS-CoV-2 Nsp14由527个氨基酸组成，含有26个脯氨酸和23个半胱氨酸(红色标记的氨基酸)，蛋白分子大小为59.97 ku(图1)。如图1所示的nsp14序列(proto sequence)包含较多不利于大肠杆菌表达的密码子，同时，一些主要的稀有密码子(黑色方框)呈现近距离分布和串联分布。经分析后，将这些密码子优化为利于大肠杆菌表达的偏好性密码子(OPTI sequence)。

proto sequence.nucleotide sequence of SARS-CoV-2 proto strain nsp14; OPTI sequence, nucleotide sequence of SARS-CoV-2 proto strain nsp14 with optimization of codon preference in E.coli; the letters in black box, the main rare codons and their encoded amino acids

2.2 重组表达质粒的构建与鉴定

利用pET-30a(+)、pET30a-linker-sumo和pGEX-6P-1载体构建pET30a-linker-Nsp14、pET30a-linker-OPTI-Nsp14、pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14和pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14重组表达质粒，构建策略如图2 A所示。pET30a-linker-Nsp14 和pET30a-linker-OPTI-Nsp14质粒的经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后的片段大小为5 257和1 616 bp，pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14质粒经NotⅠ和XbaⅠ双酶切后的片段大小为5 204和1 963 bp，pGEX-6P1-GST-OPTI-Nsp14质粒经NcoⅠ和EcoRⅤ双酶切后的片段大小为3 387和3 154 bp，4个重组质粒的双酶切鉴定结果均与预期结果符合(图2B)。4个质粒经DNA测序鉴定的结果也均正确(结果未展示)。

2.3 鉴定目的蛋白的可溶性表达

计算4个重组质粒表达产物的分子大小分别为60.97、60.97、72.40和86.38 ku。4个质粒经诱导表达后得到了与预期大小一致的目的蛋白条带(图3)。鉴定结果显示，4个质粒的表达产物大部分以包涵体的形式存在于超声沉淀中(图3A～D左图，pellet泳道)。除了pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14质粒的超声上清液中可检测到预期蛋白条带外(图3D右图，supernatant泳道)，其他质粒均未能检测到明显的目的蛋白条带(图3A～C 右图，supernatant泳道)。

2.4 优化表达温度

pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14质粒表达温度优化的结果显示，当诱导表达的温度为37 ℃时，可明显降低目的蛋白的可溶性表达量(图4，泳道2)。将表达温度降到20 ℃和13 ℃后，可溶性表达量的差异不明显(图4，泳道6；泳道8)。相较于以上的表达温度，当pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14诱导表达于30 ℃时，可检测到较高的可溶性表达量(图4，泳道4)。

A.construction strategy of the four Nsp14 recombinant plasmids; B.enzyme digestion of the recombinant plasmids: M.DNA marker; 1.enzyme digestion of pET30a-linker-Nsp14(Nde Ⅰ, Sal Ⅰ); 2.enzyme digestion of pET30a-linker-OPTI-Nsp14(Nde Ⅰ, Sal Ⅰ); 3.enzyme digestion of pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14(Not Ⅰ, Xba Ⅰ); 4.enzyme digestion of pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14(Nco Ⅰ, EcoR Ⅴ)

M.protein marker; A.expression identification of pET30a-linker-Nsp14(left: Coomassie Brilliant blue staining, right: Western blot of His-tag antibody); B.expression identification of pET30a-linker-OPTI-Nsp14 (left: coomassie brilliant blue staining, right: Western blot of His-tag antibody); C.expression identification of pET30a-linker-sumo-OPTI-Nsp14 (left: coomassie Brilliant blue staining, right: Western blot of His-tag antibody); D.expression identification of pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14 (left: Coomassie Brilliant blue staining, right: Western blot of GST-tag antibody)

2.5 表达与纯化目的蛋白

pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14重组质粒的表达产物经纯化后发现，通过考马斯亮蓝色不能明显地检测到超声上清液中的Nsp14融合蛋白(图5A，泳道1)，经亲和纯化后可观察到目的蛋白条带(图5A，泳道2)。3C蛋白酶作用后，Nsp14融合蛋白被剪切为2个蛋白条带，其分子质量与Nsp14(59.97 ku)和标签蛋白(26.43 ku)的预期大小相符合(图5A，泳道3)。酶切液经亲和纯化后可明显去除标签蛋白(图5A，泳道4)。分子筛进一步纯化后，可见一个含Nsp14融合蛋白的紫外吸收峰(图5B)，测得其蛋白浓度为0.24 mg/mL(图5A，泳道5)。

2.6 Nsp14核酸酶活性的分析

纯化后的Nsp14酶活性分析结果表明，Nsp14对dsRNA具有核酸酶活性(图6)。酶切Nsp14 dsRNA的程度与其终浓度成正相关。如图6黑色箭头所示，随着Nsp14的终浓度增大，dsRNA被酶切后形成的小片段数量增多。当Nsp14的终浓度为500 nmol/L以上，可观察到明显的核酸酶作用。

M.protein marker; A.identification of the target protein in processes of purification: 1.supernatant; 2.the fusion protein with a GST tag purified through glutathione affinity column; 3.the fusion protein with GST tag was excised by 3C protease; 4.the protein liquid of the lane of 3 purified through glutathione affinity column; 5.concentrated protein solution of 13-16 samples from Fig 5B; B.the protein liquid of the lane of 4 in Fig 5A purified through a molecular sieve column (Superdex200 Increase 10/300 GL)

+.1 mg/mL RNase A substituted Nsp14 as a control图6 7 mol/L尿素的PAGE分析Nsp14的核酸酶活性分析Fig 6 Analysis of nuclease activity of Nsp14 by PAGE with 7 mol/L urea

3 讨论

非结构蛋白14(Nsp14)在冠状病毒中保守性较高，是研发广谱抗病毒治疗药物的潜在靶点。现有的部分酶抑制剂药物可明显的抑制Nsp14的酶活性功能，在细胞水平展现出协同抑制病毒基因组复制的作用[9]。但作为广谱抗病毒药物的研发，还需要进一步明确Nsp14的结构特征，为药物的作用机制研究提供坚实的理论基础。国内外研究已通过定点突变、反向遗传学和构建融合蛋白等方法，对Nsp14进行结构改造研究，以期进一步发现Nsp14的结构与功能关系。

对于大肠杆菌而言，SARS-CoV-2 Nsp14的序列中稀有密码子较多，且稀有密码子呈现串联分布，这可能不利于Nsp14的表达[10]，需要对Nsp14序列进行优化。基于SARS-CoV-2与SARS-CoV的Nsp14氨基酸序列同源性为90%以上[11]，本文参考了SARS-CoV Nsp14 序列表达所使用的linker(MGHHHHHHGS)和sumo融合标签[8, 12]，以构建SARS-CoV-2 Nsp14蛋白的表达质粒。然而，这些融合标签在本文中均不能显著地提高可溶性表达量。最终，本文利用GST融合标签构建的pGEX6P1- GST-OPTI-Nsp14质粒可显著地提高Nsp14的可溶性，这提示不同融合标签的促溶效果可能不同。pGEX6P1-GST-OPTI-Nsp14重组质粒表达的Nsp14融合蛋白携带GST标签，可被3C蛋白酶特异性的剪切并去除[13]，再通过分子筛纯化后得到了纯度较高的Nsp14。本文中Nsp14的表达量较低，1 L的表达菌液可获得约0.1 mg Nsp14，这可能因Nsp14自身含有大量脯氨酸和半胱氨酸以及分子量较大等特性，降低了其在大肠杆菌中的可溶性表达[14]。本研究经纯化后的Nsp14对dsRNA具有核酸酶活性，下一步试验中将通过构建MERS-CoV和SARS-CoV病毒的Nsp14重组表达质粒，以制备不同冠状病毒的Nsp14，为广谱抗病毒药物的研发提供有利的条件。