木霉菌在月季土壤条件下的定殖能力比较

徐传训

（聊城大学，山东 聊城 252000）

木霉菌属于真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，木霉属[1]，它主要存在于土壤中，是土壤中重要的微生物群落[2]。对木霉菌株进行改良、选育不但能使其在农药、肥料等不利条件下更好地生存，而且可提高木霉菌株的生防能力，也是目前的研究热点之一[3]。木霉菌在土壤的定殖过程中会受到很多因素的影响，比如土壤营养物质、土壤微生物和培养天数等，其中土壤营养物质和培养天数是限制木霉菌定殖的主要因素[4-7]。针对此问题，根据月季土壤的理化性质下对两种木霉菌丝生长和产孢量的影响，筛选出生防效力及定殖能力较高的菌株。

1 材料与方法

1.1 菌种及培养

供试菌种为长枝木霉（T.longissima）SMF2和哈茨木霉（T.harzianum）T39。采用PDA培养，在基于25±1 ℃的条件培养。

1.2 培养时间设定

培养液为PD培养液，时间处理以3天为起始，每2天为一个周期，培养到第15天，培养天数分别是3、5、7、9、11、13、15。

1.3 培养基

马铃薯葡萄糖培养基：新鲜的马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL、pH自然状态进行配制。

固体培养基：测定土样0.3 g、蒸馏水30 mL、琼脂0.6 g进行配制。

液体培养基：蒸馏水100 mL、土样1 g进行配制。

PDA培养基接上木霉菌的菌饼后，放在恒温培养箱中在25±1 ℃并且要求黑暗条件和光照条件各12 h的条件下培养3天备用。

1.4 仪器

JM-A10002电子天平、PHS-3C型pH计、OLYMPUS生物显微镜BX51、MSL-3750高温蒸汽灭菌锅、BS-2E震荡培养箱、SPX-50B全自动智能型生化培养箱、RE52CS旋转蒸发器、B-220恒温水浴锅、SW-CJ-2FD净化工作台、CMAX PLUS酶标仪、火焰分光光度计。

1.5 供试药品

0.136 mol/L硫酸重铬酸钾（K2Cr2O7-H2SO4）的标准溶液、0.2 mol/L硫酸亚铁（FeSO4）标准溶液、邻啡罗啉（邻二氮菲）指示剂、1.8 mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液、1.2 mol/L氢氧化钠（NaOH）溶液、2%硼酸溶液、0.01 mol/L盐酸标准溶液、定氮混合指示剂、凡士林、粉末硫酸亚铁（FeSO4）、浓硫酸、饱和重铬酸钾（K2Cr2O7）溶液、40%氢氧化钠（NaOH）溶液、2%硼酸溶液、定氮混合指示剂、0.02mol/L盐酸标准溶液、活性炭、硫酸钼锑抗混合显色剂、H中性1.0 mol/L醋酸铵（NH4OAc）溶液、K标准溶液。

1.6 试验方法

1.6.1 菌种活化

将保存的哈茨木霉T39和长枝木霉SMF2菌株接种到PDA平板，活化5~9天，备用。

1.6.2 菌丝及孢子变化

将已活化的菌种按直径为5 mm的小菌块分别接种于不同土壤培养基中，然后置于28 ℃培养箱里避光培养。试验设3个处理，每个处理设3次重复，每12 h观察并测量菌丝生长情况。菌丝生长的速度（mm/d）=（菌落的直径-菌种块直径）/菌落生长的时间，结果取平均值。

将菌种制成孢子悬浮液，在液体培养基接菌后的第3天、第5天、第7天、第9天、第11天分别把接菌的土样用滤纸过滤并放入烘箱内烘干，同时对滤液中的孢子数进行计数，并选出木霉菌繁殖最快的天数。

1.6.3 土壤样品的采集

分别在月季园用“S”形取样法，采集0~20 cm耕层土壤样品，风干、研磨过筛，用于供试地土壤常规养分分析。

1.6.4 土壤养分含量测定

碱解氮的测定采用碱解扩散法，速效钾的测定采用醋酸铵-火焰光度计法，速效磷的测定采用碳酸氢铵法，有机质的测定采用重铬酸钾法。

1.6.5 数据统计

利用Microsoft Excel 2020软件处理数据，采用DPS数据处理系统9.01中的Duncan法进行多组样本间差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 土壤对木霉菌生长速率的影响

由表1可知，月季土壤对哈茨木霉和长枝木霉菌丝生长有促进作用。

表1 生长速率

2.2 土壤对木霉菌产孢量的影响

木霉菌的孢子量是一直在上升的，哈茨木霉的孢子量大于长枝木霉的孢子量。哈茨木霉主要增加孢子量，长枝木霉主要增加菌丝量。

在培养4天的条件下，哈茨木霉T39的产孢量高于长枝木霉SMF2。木霉菌在土壤中第7天的孢子增长率最高，其余天数的孢子增长率相差不大。这就说明木霉菌在土壤中第7天达到繁殖的高峰，此时木霉菌活性最高，防治效果最好，此时也是木霉菌最佳的定殖时间。此外，两种木霉菌相比而言，哈茨木霉T39的产孢量和孢子增长率均高于长枝木霉SMF2。

2.3 木霉菌培养过程中的形态特征

根据设计的试验，月季土壤培养基的木霉菌丝生长最快、产孢最多。长枝木霉在PD培养基中以菌丝生长为主，且含月季土的PD培养基中的菌丝量大于不含土的PD培养基，因此，月季土壤有利于长枝木霉的生长。

2.4 土壤养分含量与木霉菌生长繁殖的关系

有机质含量随着木霉菌的生长呈现下降与升高的趋势。表明不仅植物的生长需要有机质，木霉菌的生长同样需要，所以培养基中会出现有机质含量下降的情况。随着时间的增加，木霉菌的数量在不断增加。木霉菌本身就是有机质，木霉菌繁殖得越快越多，有机质的含量就会增多。

由于木霉菌自身的活动增加了碱解氮的含量，导致碱解氮含量上升，碱解氮含量越高，木霉菌生长速度越快，消耗碱解氮速度越快，有机质的含量就会增加。

速效磷是土壤中可以被直接被利用的磷元素。长枝木霉中的速效磷含量随着时间的增加呈现升高的趋势。但是，哈茨木霉中的速效磷随着时间的增加呈现先升高，后平稳的状态。

速效钾是土壤中可以被植物与微生物直接利用的钾元素，与微生物生长息息相关。随着速效钾含量的减少，木霉菌在生长。速效钾含量高，使得木霉菌生长速度快，消耗速效钾速度快。所以速效钾有利于木霉菌的定殖。

3 结论与讨论

3.1 结论

3.1.1 长枝木霉SMF2生长繁殖最快

哈茨木霉T39和长枝木霉SMF2在两种土壤样本中的菌丝生长状况和产孢量差距很大。木霉的菌丝生长速率、产孢量在月季土壤明显高于CK，月季花卉使用的有机肥较多，在加上月季的根系分泌物的作用，使木霉菌生长繁殖效果最好。

结合测定土壤样本的指标来看，木霉菌的菌丝生长速率和产孢量与土壤氮磷钾以及有机质的含量密切相关。其次，除了培养72 h外，哈茨木霉T39与长枝木霉SMF2相比，长枝木霉SMF2的菌丝生长速率均要稍高于哈茨木霉T39。

3.1.2月季土壤样本中不同营养条件对木霉菌定殖的作用

不同的土壤营养条件对木霉菌定殖的影响不同。土壤样本中土壤的有机质、碱解氮、速效钾的含量高，综合起来看这就是两种木霉菌在月季土壤中菌丝生长速率和产孢量高的原因。

3.1.3 木霉菌定殖能力与土壤处理有密切的关系

土壤处理对木霉菌丝生长和产孢的影响不同。氮磷钾含量的变化对木霉菌丝生长略有影响但对产孢的影响不明显。

碱解氮是土壤中可以被植物与微生物直接利用的氮元素，所以培养基中会出现碱解氮含量下降的情况。但是，随着碱解氮含量的减少，木霉菌在生长。随着时间的增加，木霉菌的数量在不断增加。由于木霉菌自身的活动增加了碱解氮的含量，使得碱解氮含量上升，碱解氮含量越高，木霉菌生长速度越快，消耗碱解氮速度越快，所以在木霉菌定殖过程中，增施氮肥，有利于木霉菌的定殖。

3.1.4 处理天数对木霉菌定殖能力的影响

真菌的生长繁殖也需要充足的有机质。本试验中木霉菌分别在第3天、5天、7天、9天、11天处理了土壤样本，均得出了随着处理天数的增加，土壤中的有机质逐渐减少的结论。此外，对于不同木霉菌对有机质的消耗而言，在月季土壤中长枝木霉SMF2高于哈茨木霉T39，说明在木霉菌定殖的过程中需要不断消耗土壤中的有机质，有机质的含量多少直接影响了木霉菌的定殖能力。

3.2 讨论

木霉菌在土壤环境的改良、土壤肥力的提高方面越来越受到国内外专家的重视，木霉菌尤其在影响土壤理化性质方面表现突出。孙冬梅等[8]研究发现黄绿木霉处理土壤后，土壤的养分含量相比未处理的时候有所增加，改善了土壤理化性质，增加了根际微生物的数量。在施用木霉菌制剂的土壤中，土壤的全氮含量、碳氮比均比用化肥处理的土壤中高，且木霉菌的浓度越高处理的效果越明显。

土壤的肥力由理化性质、土壤的酶活性、微生物的数量等因素共同决定，研究表明，木霉菌处理后的土壤里细菌和放线菌的数量也有所增加，某些放线菌具有固氮的作用，从而使土壤中的氮素不断增加，有利于满足作物对氮素的需求[9]。施肥是农作物生产中的必要措施，氮磷钾肥是作物生长中不可缺少的肥料，合理施肥有利于作物生长，也有利于作物根际包括生防菌在内的有益微生物生长。

试验结果证实，木霉生防菌受肥料种类及其剂量的影响，酸性肥料和适当的氮磷钾肥配比有利于木霉菌丝生长和产孢，并有可能有利于木霉菌的根际定殖。

3.3 展望

木霉菌因在土壤微生物防治、抗生素的科学研究以及生物酶等诸多方面的应用有着十分重要的经济价值和社会价值，近年来受到广泛的社会关注。木霉菌生防制剂可以增强植物的抗逆性，促进对土壤养分的有效吸收利用，加速对土壤中一些有害物质的有效分解。并且木霉菌植株生长的速度快，可大规模生产，对土壤环境也无任何污染。目前木霉菌生防制剂得到了推广和综合利用，木霉菌生防制剂既可以有效防止土传病害又可以有效改善植株根际的微环境，有利于其他有益菌的生长繁殖[10]。木霉菌的生防制剂与生物肥料具有投资少、产量高、绿色无公害三重优点，是未来药剂和肥料发展的重要方向。