棘胸蛙出血性败血症的病原菌分离鉴定与病理学研究

任思宇，吴春艳，汪开毓，王雯慧，刘震坤，杨延辉

( 1.重庆三峡职业学院，重庆 404155； 2.甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070； 3.四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130 )

棘胸蛙(Quasipaaspinosa)，俗称石棒、石蛙等，属叉舌蛙科棘胸蛙属，主要分布于我国南部山区的溪流生境中。20世纪80年代初期，国内便开始了棘胸蛙的人工养殖，2000年后逐步实现了规模化发展。随着行业规模的扩大，高致死的细菌性传染病逐渐成为制约棘胸蛙养殖的关键因素，目前已有致病性蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)[1]、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacterbraakii)[2]、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[3-4]及肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)[5]等感染棘胸蛙后导致严重死亡的报道。2019年6月，重庆市石柱县某养殖场的棘胸蛙出现大量死亡，死亡蛙呈典型的出血性败血症症状，可见明显的红腿与腹水症；个别病蛙单侧眼浑浊，整个养殖场的发病率约40%，某些单独养殖室内的发病率接近60%，发病后死亡率约80%。笔者采集病样，进行实验室病原学检测，开展药敏试验、组织病理学与超微病理学等研究，旨在明确该病的致病原因，探索感染后造成的病理损伤，为棘胸蛙的健康养殖与疾病防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

发病棘胸蛙体质量为(130±20) g，采自重庆市石柱县某养殖场。健康棘胸蛙表现活跃，体表无损伤，体质量(120±10) g，购自重庆市彭水县某养殖场，实验室暂养7 d后未见任何疾病表现；在回归感染前，随机选取其中5只蛙进行寄生虫与细菌的检测，未发现有感染。健康棘胸蛙暂养于实验室内的玻璃缸中，缸内水深约1 cm，并铺设干养区。每日换水1次，控制环境温度为(25±2) ℃。每日8:00、18:00投喂黄粉虫，自由采食。脑心浸出液肉汤(BHI)，购于北京陆桥技术有限责任公司；2×Taq PCR Mastermix (KT201)、细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)，购于天根生化科技(北京)有限公司；细菌微量生化反应管、药敏纸片，购于杭州微生物试剂有限公司；血平板(成品培养基024070)，购自于广东环凯微生物科技有限公司；嗜水气单胞菌CW(基因登录号：MN475912)，由“长江上游鱼类资源保护与利用”四川省重点实验室惠赠。

1.2 病原菌的分离纯化

取发病棘胸蛙的体表溃疡处组织、体表黏液以及肠道内容物制作压片，采集心血制作血涂片以检测寄生虫的感染。在无菌条件下，用接种环挑取发病棘胸蛙的肝脏与腹水，划线接种于BHI平板上，28 ℃恒温培养24 h后，挑取单一的优势菌落进行纯化培养，获得纯化菌株。

1.3 回归感染试验

将健康棘胸蛙随机分为5组(10尾/组)，其中4组为感染组，1组为对照组。感染组中，每组分别腹腔注射密度为1×105、1×106、1×107、1×108cfu/g的病原菌生理盐水重悬液，每尾注射量为0.2 mL；对照组腹腔注射等量的无菌生理盐水。接种后连续观察14 d，记录棘胸蛙死亡的时间与数量，并进行细菌的再次分离鉴定。

1.4 表型特征鉴定和16S rDNA、gyrB基因鉴定及系统发育分析

参照文献[6]对分离菌进行表型特征鉴定，并将其接种于血平板上，观察溶血特性，并将嗜水气单胞菌CW作为参照菌株共同进行试验。抽提分离菌的DNA作为模板，采用16S rDNA与gyrB基因的相关引物进行PCR扩增，扩增产物纯化后提交至北京擎科生物科技有限公司成都分公司进行测序分析。序列结果在GenBank中进行BLAST比对分析，并采用MEGA 6.0构建系统发育树。PCR反应体系为：25 μL的2×Taq PCR Mastermix，2 μL模版DNA，2 μL上游引物，2 μL下游引物，加水至50 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，54 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min。16S rDNA、gyrB基因的扩增引物分别为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，3′-TACGGC TACCTTGTTACGAC-5′；5′-GAAGTCATCATG ACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，3′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNA CRTCNGCRTCNGTCAT-5′。

1.5 药敏试验

无菌条件下将密度为1.0×107cfu/g的病原菌液涂布于BHI平板上，用灭菌后的镊子将药敏纸片粘贴于平板表面，28 ℃恒温培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径(重复3次)，根据杭州微生物试剂有限公司抑菌圈标准判定该细菌的药物敏感性。

1.6 组织病理学观察

取自然发病和健康棘胸蛙的肝脏、肾脏、脾脏、心脏及脑等组织，固定于10%中性甲醛溶液中，制作石蜡切片，经苏木精-伊红染色后，置于显微镜(LC30，Olympus CX33)下观察并采集病理图片。

1.7 超微病理学观察

将自然发病和健康棘胸蛙的脾脏(组织大小为1 mm×1 mm×2 mm)，固定于4 ℃预冷的电镜专用固定液(2.5%的戊二醛溶液)中。透射电镜样品经洗涤后放入1%的锇酸中固定2～4 h；梯度丙酮脱水后，放入1∶1(体积比)的环氧树脂和丙酮中置换2 h，再放于纯环氧树脂中40 ℃置换2 h；包埋固化后经醋酸双氧铀-柠檬酸铅染色，放于透射电子显微镜(日立H-600IV)下观察。

2 结 果

2.1 发病棘胸蛙的临床症状

自然发病蛙均出现行动迟缓、精神沉郁、食欲减退的症状，半数以上的病蛙脚掌处可见溃烂，个别病蛙出现单侧或双侧眼浑浊(图1a)。约75%的病蛙在发病后的3 d内死亡，病蛙腿部、腹部发红肿胀(图1b、图1c)，蹼间出血明显(图1d)，口腔中可见出血点或出血斑(图1e)；病蛙死亡前全身颤抖、站立不稳或出现不规则的转圈运动，死亡时四肢僵直。解剖后可见肝脏出血(图1f)，脾脏颜色暗黑、极度肿胀(图1g)，肠系膜严重充血(图1h)，并伴有大量腹水。约5%的病蛙在发病后5～10 d死亡，病蛙体表及内脏器官的出血情况相对较轻，但可见心包积液，个别可见典型的绒毛心症状(图1i)。

图1 自然发病棘胸蛙的临床症状与解剖学变化

2.2 病原菌的分离与回归感染

发病棘胸蛙经采集心血制作血涂片，采集肠道内容物、体表黏液及溃疡处组织制作压片后，显微镜下观察未发现寄生虫感染。从病蛙的肝脏与腹水中分离出1株优势菌SZW-003，该菌在BHI平板上长势良好，28 ℃培养24 h后可长出淡黄色菌落，菌落边缘整齐，表面圆润。

腹腔注射SZW-003菌株的生理盐水重悬液后12 h，棘胸蛙反应迟钝，对换水、投喂等刺激因素不敏感，执握时挣脱能力下降。最高密度组在接种后18 h即出现死亡，其他各组在第2、3天均陆续出现死亡。感染蛙的临床症状及病理表现和自然发病棘胸蛙相似，呈出血性败血症表现(图2)。7 d后，感染试验组再无死亡现象，试验过程中对照组无任何变化(表1)。通过寇氏法计算得出菌株SZW-003对棘胸蛙的半致死密度为1.59×106cfu/g；从回归感染组发病棘胸蛙的肝脏中再次分离细菌，获得的菌株16S rDNA和gyrB测序结果与菌株SZW-003一致。

图2 回归感染棘胸蛙的临床症状与解剖学变化

表1 菌株SZW-003的人工感染试验结果

2.3 病原菌的表型特征鉴定

生理生化反应显示：菌株SZW-003山梨醇、山梨糖、鼠李糖、尿素、肌醇为阴性；枸橼酸盐、硝酸盐还原、葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、半乳糖、胆汁七叶苷、硫化氢、吲哚、硫化氢、V-P试验、木糖、乳糖、赖氨酸、精氨酸为阳性(表2)。将菌株接种于血平板上呈典型的β溶血。

表2 菌株SZW-003分离株与参照菌株的生理生化特性

2.4 病原菌的系统发育分析

对菌株SZW-003的16S rDNA与gyrB基因进行扩增，分别得到1400 bp及约1100 bp的PCR产物，将测序结果进行BLAST比对分析，用MEGA 6.0构建系统发育树。16S rDNA的结果显示，菌株SZW-003与嗜水气单胞菌(MF079290、MF716694)的同源关系最近(图3)。gyrB的结果显示，菌株SZW-003与编号为JX025785、JQ085472的嗜水气单胞菌在发育树中聚在一簇，亲缘关系最近(图4)。上传菌株SZW-003序列至GenBank，获得16S rDNA登录号为MW767835，gyrB基因登录号为MZ223373。

图3 菌株SZW-003的16S rDNA系统发育树

图4 菌株SZW-003的gyrB序列系统发育树

2.5 嗜水气单胞菌SZW-003的药物敏感性

药敏试验结果显示，嗜水气单胞菌SZW-003对恩诺沙星、四环素、阿奇霉素、氧氟沙星、左氧氟沙星、氟苯尼考、头孢噻肟、庆大霉素等多种药物敏感，对头孢氨苄、阿莫西林、青霉素、氨苄西林等药物耐药(表3)。

表3 嗜水气单胞菌SZW-003药物敏感性试验

2.6 组织病理学观察

组织病理学观察结果表明：病蛙肝脏中部分肝细胞肿胀，呈局灶性的裂解坏死，但未出现炎症细胞的浸润(图5a)；脑组织中大量神经细胞肿胀变性，细胞核消失，胞内精细成分不清晰，并可见空泡状结构(图5b)；肾小管上皮细胞透明变性，呈均质的红染结构，局部肾小管裂解脱落仅见轮廓；肾间质的结缔组织松散，纤维断裂，大量单核细胞及中性粒细胞浸润(图5c、图5d)；心肌纤维未出现明显损伤，但心包膜极度肿胀，其外可见大量的炎性渗出物，包含中性粒细胞、浆细胞及单核细胞，部分炎性细胞坏死裂解后仅剩细胞核残片(图5e)；脾红髓细胞排列疏松散乱，大量红细胞瘀滞其中，纤维架构大面积断裂，脾索消失，完整性严重受损，网状细胞坏死脱落(图5f)；白髓中淋巴细胞排列疏松，出现核固缩样坏死，白髓面积显著缩小，周围的黑色素巨噬细胞中心崩解消失(图5g)；肺与肠道未出现明显的病理变化。

健康棘胸蛙肝脏染色清晰，细胞界限明显(图5h)；脑组织中神经细胞正常，细胞核与核仁可辨(图5i)；肾脏中肾小球与肾小管着色适中，未见透明变性与炎症细胞浸润(图5j)；心脏中心肌纤维正常，心外膜与心包膜典型，心包腔中无炎性渗出物(图5k)；脾脏红白髓结构清晰，未见充血、出血及纤维断裂(图5l)。

图5 自然发病棘胸蛙与健康棘胸蛙的组织学观察

2.7 超微病理学观察

超微病理学研究显示，发病棘胸蛙脾脏内细胞离散，嗜酸性粒细胞坏死，纤维肿胀断裂，细胞碎片散乱分布于细胞间(图6a、b)；血管壁胶原纤维肿胀断裂，管内外均可见裂解的纤维残痕；较正常的网状细胞表面可见大量胞质突起，但含有较多肿胀溶酶体的网状细胞胞质突起减少，正在向典型与非典型两类黑色素巨噬细胞转变(图6c、d)；受损的网状细胞内线粒体肿大，淋巴细胞空泡化明显(图6e)；游离的巨噬细胞中可见吞噬的细菌颗粒(图6f)。健康棘胸蛙超微结构观察显示，细胞间距正常，纤维结构清晰未断裂，脾索内皮细胞完整，脾窦内分布有适量的红细胞(图6g、h)。

图6 发病棘胸蛙与健康棘胸蛙脾脏的透射电镜观察

3 讨 论

3.1 棘胸蛙感染嗜水气单胞菌后的临床症状

20世纪70—90年代，人们发现嗜水气单胞菌的感染给无尾类的生存造成了巨大隐患，甚至认为该菌是无尾类自然种群规模下降的重要原因[7-8]。本试验中，棘胸蛙多在发病后3 d内死亡，表现出多组织器官的广泛性出血，这与已有的报道[9-10]一致。但值得注意的是，本试验中少数病蛙的出血症状轻微，但可见心包积液及绒毛心；该类病蛙约在发病后5～10 d死亡，推测是因循环系统功能的严重受损所致；搜索文献后发现，本试验是无尾类感染嗜水气单胞菌后出现心包积液与绒毛心的首次报道。尽管本试验中，嗜水气单胞菌感染棘胸蛙后发生了败血症，但有研究显示，败血症只是细菌感染后所引发的一种临床症状，不同细菌的感染均可引发[11]，因此不能成为疾病确诊的依据，有关病原的诊断还需要结合实验室方法进行鉴定。

3.2 棘胸蛙出血性败血症的病因分析

Forbes等[12]研究表明，无尾类自身免疫功能受到抑制是导致嗜水气单胞菌感染的重要原因。他们发现，无尾类在冬眠期间因免疫功能降低可引发感染，尤其在冬眠后的回暖期，病菌繁殖加快，但机体免疫能力未能随之激活，此时易出现发病的高峰期，且体表损伤可显著提高疾病的发生率。本病例发病时的环境温度为13.0～18.5 ℃，而棘胸蛙的最适生存温度为20～27 ℃；此外，当环境温度回升至15.7 ℃时棘胸蛙便出现繁殖行为[13-14]。因此，笔者认为低温限制了棘胸蛙的免疫功能是本次疾病发生的根本原因，而求偶打斗与摄食竞争导致的体表损伤更促进了病菌的感染，这与已有的研究结果相一致。

3.3 棘胸蛙出血性败血症的病理分析

3.4 棘胸蛙出血性败血症的防控建议

药敏试验显示，嗜水气单胞菌SZW-003菌株对阿莫西林、青霉素及头孢氨苄等β内酰胺类药物耐药，而对喹诺酮类、氯霉素类及四环素类等药物敏感，这与已报道的棘胸蛙源及其他蛙源的嗜水气单胞菌药敏结果相似[22-24]。与此不同的是，近年来源于大鲵与鱼类的嗜水气单胞菌大多表现出耐药谱广、耐药率高等特点，尤其对恩诺沙星、氟苯尼考等水产常用抗生素表现出严重的耐药性[15,19]，有学者研究认为，这与大鲵和鱼类养殖过程中滥用抗生素，造成水环境中嗜水气单胞菌的获得性耐药不断加重有关[19]。虽然无尾类对水环境的依赖程度较低，且目前蛙源的嗜水气单胞菌对许多水产用抗生素依然敏感，但生产上也一定要克服未明确病原就盲目使用抗生素的情况，避免在将来出现无药可用的局面。此外，有报道显示，无花果根、银合欢种子及葫芦巴等植物性药物在控制嗜水气单胞菌感染时有良好的效果[25-26]，因此，加强植物性药物的研发与使用可能是将来有效防治嗜水气单胞菌病的重要途径。

4 结 论

本试验确定了嗜水气单胞菌是导致此次棘胸蛙出血性败血症的病原菌，该菌感染后可造成棘胸蛙脾脏、心外膜等多个组织器官的病理损伤，最终导致严重的功能障碍而死亡。该病原对许多抗生素呈现出耐药性，尤其对β内酰胺类抗生素广泛耐药，此次疫病可结合氟苯尼考、恩诺沙星等药物进行治疗。