中药降脂复方对新西兰白兔胆固醇-胆汁酸代谢的调节*

陈瑜，邱冬妮，孙思佳，卓家隆，廖阳勃，孙旭，毛奇琦，丁伟群，邱志兵，邵雷

复旦大学附属华山医院，上海 200040

高胆固醇血症属于一种代谢紊乱性疾病，随着人们生活水平的改善及饮食习惯的改变，使得高胆固醇血症具有较高的发生率[1]。高胆固醇血症的发病周期长，治疗较困难，目前尚无特效治疗方法。高胆固醇血症的出现可升高脑卒中、心肌梗死等心血管疾病的发生率，因此，对高胆固醇血症做出诊断并及时干预，对于预防其并发症具有重要意义[2-3]。目前，治疗高胆固醇血症的药物有很多，治疗效果存在差异，有些药物降低胆固醇的作用显著，但是其带来的不良反应不容忽视。因此，找寻一种治疗效果好、不良反应少的降胆固醇药物是临床的迫切需求[4]。中药降脂复方的降脂效果已被临床证明，且无明显不良反应[5]。法尼酯衍生物X受体(farnesoid X receptor，FXR)是近年发现的对脂质代谢及糖代谢有调节作用的受体，在高胆固醇血症患者中，FXR呈现过量表达[6]。在胆汁酸经典合成途径中，胆固醇7α羟化酶(cholesteral 7α-hydroxylase，CYP7A1)是调节胆汁酸合成的限速酶[7]。与FXR类似，肝X受体(liver X Receptor，LXR)也是肝细胞内一种核受体，FXR被视为CYP7A1的转录抑制因子，LXR则为CYP7A1的转录激活因子。FXR正向调节靶基因有胆盐输出泵(bile salt export pump，BSEP)与胆汁酸生理性配体小异源二聚体伴侣(short heterodimer partner，SHP)[8]。LXR的正向调节靶基因则是三磷酸腺苷结合盒转运蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)[9]。上述靶基因mRNA大量表达可以反映其核受体处于激活状态，反之则为非激活状态。目前已有研究发现，FXR、LXR可通过介导相关的信号转导通路来调节胆固醇向胆汁酸转化的过程[10-11]。针对这一发现，本实验选用新西兰白兔作为研究对象，构建高胆固醇血症模型，并对其进行中药降脂复方干预，观察各组干预前后CYP7A1的活性以及SHP、BSEP和ABCA1mRNA相对表达量的改变，以探讨中药降脂复方对胆固醇-胆汁酸代谢的干预作用，为中药降脂复方的临床应用提供依据。

1 材料

1.1 动物选取60只12～16周龄新西兰白兔，体质量2.5～3.0 kg，购自河北医科大学动物中心，合格证号：20118-0009，所有家兔均适应性喂养1周，室温22～25 ℃，湿度50%～60%，自由摄食及饮水。本研究经复旦大学附属华山医院伦理审查委员会审批通过，伦理审批号：(2019)第(77)号。

1.2 药物与试剂中药降脂复方(规格：5 g/袋，南京厚生药业有限公司，批号：20200113)；总胆固醇(total cholesterol，TC)检测试剂盒(上海名典生物工程有限公司，货号：XY-50065)；总胆红素(total bilirubin，TBIL)试剂盒(上海通蔚生物科技有限公司，货号：TW15954)；总胆汁酸(total bile acid，TBA)试剂盒、SYBR Green PCR试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司，货号：ARB13142、BTN131042)；CYP7A1酶联免疫吸附测定试剂盒(上海沪震公司，货号：hz-M0394c)；Trizol试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，货号：R30506-50T)。

1.3 仪器OlympusAU600型全自动生化分析仪(日本奥林巴斯公司)；ELX800型酶标仪(美国Bio-Tek公司)；ABI PRISM® 7300型定量PCR仪(美国ABI公司)。

2 方法

2.1 动物分组、造模与干预方法采用随机数字表法将新西兰白兔随机分为对照组、模型组、中药降脂复方低剂量组和中药降脂复方高剂量组，每组15只。对照组动物喂食普通兔粮，其余组新西兰白兔给予高胆固醇兔粮(含2%胆固醇)，每只新西兰兔每日总食量约为120 g，喂养4周，且中药降脂复方低剂量组、中药降脂复方高剂量组灌胃给予中药降脂复方溶液(低剂量组2.5 g，高剂量组5 g，分别溶于20 mL生理盐水中)。对照组、模型组每天每只白兔予以20 mL蒸馏水灌胃，连续干预4周。

2.2 血清学指标检测分别于干预2周和4周进行检测。白兔禁食禁水12 h后，采集2 mL兔耳缘静脉血，常温下4 000 r·min-1离心5 min后，留取血清待测。利用OlympusAU600型全自动生化分析仪进行以下指标的检测：用酶水解法测定血清TC、TBIL的水平；用酶循环法测定血清TBA水平。

2.3 肝脏CYP7A1活性检测执行采血及其他操作后，将动物处死，解剖动物，将其肝脏取出，并切成小块于液氮中低温保存。按照酶联免疫吸附法试剂盒说明书操作，配置标准品与样品，最终于ELX800酶标仪下读取各孔在450 nm波长处的光密度值(optical density，OD)，制作标准曲线并计算CYP7A1的水平。

2.4 HE染色检测肝脏病理变化新西兰白兔采血操作完毕后，从耳缘静脉注入乌拉坦进行麻醉，取肝脏右叶组织，多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋切片，进行病理检验。

2.5 RT-PCR实验取300 mg肝脏组织，加入600 μL裂解液，制成匀浆；12 000 r·min-1离心 2 min；取400 μL上清液于EP管中，加入200 μL无水乙醇后转移到吸附柱内，12 000 r·min-1离心 1 min，弃去废液；加入500 μL RW液，12 000 r·min-1离心1 min，弃去废液；将吸附柱置入EP管中，加入40 μL DEPC，静置5 min，12 000 r·min-1离心 2 min；按照Trizol试剂盒操作说明提取总RNA并进行逆转录：37 ℃～15 min，85 ℃～5 s为1个循环；利用并遵照达辉生物公司生产的SYBRGreen PCR试剂盒进行PCR扩增：94 ℃～1 min，94 ℃～30 s，72 ℃～30 s循环230次；55 ℃～30 s，72 ℃～10 min，40 ℃～60 min保存。各基因引物序列见表1，PCR反应总体系为50 μL，内参选择GAPDH。用ABI公司生产的ABI PRISM® 7300定量PCR仪检测结果。

表1 各基因引物序列

3 结果

3.1 各组新西兰白兔血清TC、TBA、TBIL水平比较干预前，各组新西兰白兔血清TC、TBA和TBIL水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。干预2周及干预4周后，与对照组相比，各造模新西兰白兔血清TC、TBIL水平升高，TBA水平降低；与模型组相比，各给药组新西兰白兔血清TC、TBIL水平降低，TBA水平升高；与中药降脂复方低剂量组相比，中药降脂复方高剂量组新西兰白兔血清TC、TBIL水平降低，TBA水平升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表2、表3、表4。

表2 各组新西兰白兔干预前后血清TC水平比较

表3 各组新西兰白兔干预前后血清TBIL水平比较

表4 各组新西兰白兔干预前后血清TBA水平比较

3.2 各组新西兰白兔肝脏CYP7A1活性比较与对照组相比，各造模组新西兰白兔肝脏CYP7A1活性降低；与模型组相比，各给药组新西兰白兔肝脏CYP7A1活性升高；与中药降脂复方低剂量组相比，中药降脂复方高剂量组新西兰白兔肝脏CYP7A1活性升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表5。

表5 各组新西兰白兔肝脏CYP7A1活性比较

3.3 各组新西兰白兔肝脏病理变化比较对照组新西兰白兔肝脏组织结构正常；模型组可见肝细胞肿大，炎细胞浸润；给予中药降脂复方后，各组新西兰白兔肝脏病理改变有所改善。见图1。

注：A：对照组；B：模型组；C：中药降脂复方低剂量组；D：中药降脂复方高剂量组

3.4 各组新西兰白兔肝脏SHPmRNA、BSEPmRNA、ABCA1mRNA表达水平比较与对照组相比，各造模组新西兰白兔肝脏SHP、BSEP和ABCA1mRNA相对表达量升高；与模型组相比，各给药组新西兰白兔肝脏SHP、BSEP和ABCA1mRNA相对表达量降低；与中药降脂复方低剂量组相比，中药降脂复方高剂量组新西兰白兔肝脏SHP、BSEP和ABCA1mRNA相对表达量降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 各组新西兰白兔肝脏SHP、BSEP和ABCA1 mRNA相对表达量比较

4 讨论

高胆固醇饮食是出现进展性高胆固醇血症的主要原因[12-13]。研究表明，胆汁酸合成途径及胆汁酸肠肝循环为胆汁酸-胆固醇代谢性疾病的发生机制及诊断治疗提供了方向[14-15]。肠道是吸收胆汁酸的主要部位，胆汁酸还会随粪便排出体外，胆固醇在肝内合成胆汁酸能够弥补机体内丢失的胆汁酸[16-17]。FXR是肝细胞核内的胆汁酸受体，肝脏的胆汁酸可以激活FXR，调控与胆汁酸-胆固醇代谢相关基因的转录过程，如CYP7A1、SHP、BSEP等[18-19]。

本研究建立新西兰白兔的高胆固醇血症模型，并给予中药降脂复方干预，探讨模型白兔机体内胆固醇-胆汁酸的变化特点。结果显示，新西兰兔接受高胆固醇喂食后，其机体内TC和TBIL水平增高，TBA水平降低，应用中药降脂复方可使摄入高胆固醇的新西兰白兔血清TC和TBIL水平下降，TBA水平升高，剂量愈大，作用越好，提示中药降脂复方可通过影响胆汁酸在肠道内的吸收，使进入肝脏的TBA水平降低，致使血清TBA水平升高。中药降脂复方可抑制FXR的激活，并激活经典肝脏胆汁酸合成途径，TBA水平增加后，弥补肠道内丢失的TBA，维持机体内TBA的稳定状态，因在胆汁酸的合成过程中消耗掉了胆固醇及TBIL，肝脏从循环中摄取TC及TBIL的量增加，肝内胆固醇储备减少，因而使机体内TC和TBIL含量下降。

本实验结果表明，模型组、中药降脂复方低剂量组和中药降脂复方高剂量组肝脏CYP7A1活性显著低于对照组；中药降脂复方高剂量组肝脏CYP7A1活性显著较中药降脂复方低剂量组和模型组高。给予新西兰兔高胆固醇喂养后，机体内胆固醇水平增加，激活胆汁酸替代途径，并使胆汁酸池扩大，使CYP7A1的活性减弱。中药降脂复方具有益气健脾、清浊的作用。泽泻、生蒲黄及山楂等药材的降血脂作用显著，这已在很多研究中得以证实[20-21]，泽泻中的脂溶性部分含有三萜类化合物，是降血脂的有效成分，泽泻醇A、B、C的乙酸酯及生蒲黄的黄酮类物质能够显著降低胆固醇水平，并促使胆固醇从肠道排出体外，从而使机体内胆固醇水平降低，丢失的胆固醇会向胆汁酸转化，弥补胆汁酸水平，重建胆汁酸肠肝循环中新的平衡，此时会激活肝脏FXR进而激活CYP7A1转录途径[22-23]。CYP7A1的激活得益于胆固醇降解和胆汁酸合成[24-25]。本研究结果显示：模型组可见肝细胞肿大，炎性细胞浸润，而中药降脂复方低剂量和中药降脂复方高剂量组肝脏病理有所改善，推测中药降脂复方能阻止炎症级联反应，抑制肝损伤后炎性介质的分泌和释放，从而减轻对肝细胞的损伤。

本研究结果显示：模型组、中药降脂复方低剂量组和中药降脂复方高剂量组肝脏SHP、BSEP和ABCA1mRNA相对表达量明显高于对照组；中药降脂复方高剂量组肝脏SHP、BSEP和ABCA1mRNA相对表达量明显低于低剂量组、模型组。长期高胆固醇摄入引起新西兰兔血清TBA水平升高。高胆固醇血症属中医学“痰浊”“眩晕”等范畴，中药降脂复方有降低血脂作用，SHP和BSEP是FXR正向调节靶基因，ABCA1则相反[26-27]。应用中药降脂复方可抑制FXR的激活状态，促进胆汁酸经典合成途径，BSEPmRNA、SHPmRNA大量表达激活了SHP，促使ABCA1基因调控区与SHP复合为活性结合物，使得ABCA1mRNA表达水平显著增加。

综上所述，中药降脂复方能有效调节新西兰白兔胆固醇-胆汁酸代谢，可能与调控SHP、BSEP及ABCA1有关。本研究通过构建动物模型较为全面地探讨了胆汁酸-胆固醇代谢疾病的发病机制，为疾病的诊断、新靶点的确认提供依据。