白皮杉醇对脓毒症肺损伤小鼠代谢重编程的影响

熊 娟 高明朗 范国华

脓毒症肺损伤是脓毒血症最常见的并发症之一，也是ICU住院患者最常见的死亡原因之一[1]。脓毒症肺损伤的发病机制复杂，目前已被公认的发病机制包括炎症风暴、氧化应激、多种形式的细胞死亡及代谢重编程[2,3]。巨噬细胞的代谢重编程在调节其抗炎/促炎表型方面发挥重要作用[4]。既往研究表明，脓毒症肺损伤时，肺组织发生了明显的代谢重编程，糖酵解被显著激活。相反抑制糖酵解可显著减轻小鼠脓毒症肺损伤[5]。组蛋白去乙酰化酶7(histone deacetylase 7, HDAC7)是具有调控染色体的结构修饰和调节并影响基因表达的酶，可通过驱动Toll样受体4(Toll like receptor 4，TLR4)介导的糖酵解促进巨噬细胞炎性反应[6,7]。白皮杉醇是一种存在于各种水果和蔬菜中的小分子天然多酚二苯乙烯化合物，具有重要的抗炎活性，同时也是一种重要的HDAC7抑制剂，但在脓毒症肺损伤中的作用目前尚未见报道[8,9]。本研究观察并探讨白皮杉醇预处理对脓毒症小鼠急性肺损伤的影响及潜在作用机制，旨在为今后脓毒血症及急性肺损伤的预防和治疗提供一定的参考依据。

材料与方法

1.材料与试剂：脂多糖(lipopolysaccharide, LPS，纯度：98.61%)购自Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；白皮杉醇(纯度：98.09%，批号：HY-13518)购自MedChemExpress(中国)公司；一抗GLUT1(批号：ab115730)、HK2(批号：ab209847)、PDK2(批号：ab68164)、PKM2(批号：ab85555)、HDAC7(批号：ab166911)、GAPDH(批号：ab8245)、羊抗兔IgG(批号：ab52947)购自英国Abcam公司。

2.实验动物及脓毒症肺损伤模型的建立：无特定病原体(specified-pathogens free, SPF)级雄性C57/B6小鼠(平均体质量为24.11±2.83g，8～10周龄)购自湖北省实验动物研究中心。实验动物实验和管理批号：WDRM20180401。采用随机数字表法，将32只小鼠随机分为4组，即对照组、模型组、低剂量治疗组和高剂量治疗组，每组各8只。对照组不做任何处理，其他3组采用脂多糖(lipopdysaccharide,LPS,10mg/kg)单次腹腔注射的方式构建脓毒症肺损伤小鼠模型，其中低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠于LPS注射前7天分别给予25mg/(kg·d)和100mg/(kg·d)的白皮杉醇灌胃，对照组和模型组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。LPS腹腔注射12h后，处死小鼠并留取支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)和肺组织标本。本研究中所有操作均在武汉大学人民医院实验动物护理和使用委员会获得批准[批号：WDRM动(福)第20210305号]。

3.BALF中乳酸含量及乳酸脱氢酶活性的测定：LPS刺激12h后，腹腔注射浓度为1%的戊巴比妥钠麻醉小鼠，暴露小鼠胸腔后行气管插管，用特定的血管夹夹闭小鼠右肺门。随后，使用0.3ml的磷酸盐缓冲液向小鼠左肺灌注，并收集灌洗液。重复灌注2次后，将两次的灌洗液混合均匀，并于4℃下在离心机中以1000r/min的转速离心10min。获得上清液后，根据酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)绘制标准曲线，并根据各个样本的吸光度计算BALF中乳酸含量及乳酸脱氢酶活性。

4.HE染色：取小鼠肺组织于多聚甲醛(4%)中固定1天，分别用自来水和蒸馏水冲洗，并使用梯度乙醇脱水，制成蜡块后切片。将得到的肺组织切片在温箱中烘烤1h后，使用梯度乙醇脱水、二甲苯脱蜡、苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色后在光学显微镜下观察并拍照。同时对各组小鼠肺损伤情况进行评分，具体如下：0分：肺组织正常；1分：损伤少于25%；2分：损伤为25%～50%；3分：损伤为50%～75%；4分：损伤≥75%。

5.实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)检测促炎性细胞因子：使用Trizol法提取各组小鼠肺组织中总RNA后，通过反转录试剂盒获取cDNA。采用SYBRGreen PCR试剂盒进行RT-qPCR反应。具体程序如下：95℃ 60s，95℃ 15s，60℃ 20s，72℃ 45s，共40个循环，72℃延伸5min，通过2-△△CT计算各目的基因mRNA的相对表达水平，以GAPDH作为内参基因。RT-qPCR的引物序列详见表1。

表1 RT-qPCR的引物序列

6.Western blot法检测：提取各组小鼠肺组织样本中的总蛋白，并通过BCA法测定各样本中蛋白浓度，并将其煮沸变性后置于-80℃长期保存。随后对各组蛋白进行SDS-PAGE电泳，并将蛋白样品转到PVDF膜上。脱脂牛奶封闭条带后，加入对应一抗进行孵育过夜。次日，使用TBST漂洗条带后，使用二抗于摇床孵育1h。最后，使用化学发光法对各蛋白条带进行曝光，最后使用Image Lab对各泳道的灰度值进行半定量分析。

结 果

1.白皮杉醇对脓毒症小鼠肺病理损伤的影响：HE染色结果显示，模型组小鼠较对照组小鼠肺组织中出现了明显的炎性细胞浸润、肺水肿及肺泡腔出血(图1)，其肺损伤评分明显增加(表2)；与模型组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠肺组织的上述病理损伤明显减轻，肺损伤评分明显降低(表2)。此外，低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠肺泡灌洗液中乳酸含量和乳酸盐脱氢酶活性较模型组明显降低(P<0.05，表2)。

图1 小鼠肺病理切片(HE染色，×200)A.对照组；B.模型组;C.低剂量治疗组；D.高剂量治疗组

表2 各组小鼠肺损伤评分及肺泡灌洗液中损伤标志物水平

2.白皮杉醇对脓毒症小鼠肺组织炎性反应的影响：RT-qPCR检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表达水平则明显降低(P<0.05，表3)。

表3 各组小鼠肺组织中促炎性细胞因子的mRNA相对表达水平

3.白皮杉醇对脓毒症小鼠肺组织糖酵解的影响：Western blot法检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中糖酵解标志蛋白(GLUT1、HK2、PDK2和PKM2)的相对表达水平明显升高(P<0.05)；与模型组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠肺组织中GLUT1、HK2、PDK2和PKM2的相对表达水平明显降低(P<0.05，图2，表4)。

表4 各组小鼠肺组织中糖酵解标志蛋白的相对表达水平

图2 小鼠肺组织中糖酵解标志蛋白的Western blot法条带图

4.白皮杉醇对脓毒症小鼠肺组织HDAC7蛋白表达的影响：Western blot法检测结果显示，与对照组比较，模型组小鼠肺组织中HDAC7的蛋白相对表达水平明显升高(4.23±0.29 vs 1.55±0.17，P<0.05)；与模型组比较，低剂量治疗组和高剂量治疗组小鼠肺组织中HDAC7的蛋白相对表达水平明显降低(1.39±0.12、1.03±0.08 vs 4.23±0.29，P<0.05，图3)。

图3 小鼠肺组织中HDAC7的Western blot法条带图

讨 论

急性肺损伤是脓血毒症患者死亡的主要原因之一，糖酵解增加及代谢重编程可通过激活炎性反应加速肺损伤进程[10,11]。本研究中，脓毒症肺损伤小鼠肺组织促炎性细胞因子的mRNA表达水平增加，GLUT1、HK2、PDK2和PKM2的蛋白表达升高。而25mg/(kg·d)和100mg/(kg·d)的白皮杉醇预处理可明显减轻LPS诱导的小鼠肺损伤，抑制肺部炎性反应，同时降低肺组织糖酵解水平。进一步的研究揭示白皮杉醇的这种肺保护作用可能与其对HDAC7的抑制有关。

糖酵解是提供能量的重要代谢途径之一，主要发生在细胞质中，可将葡萄糖转化为丙酮酸[12]。巨噬细胞在体内主要存在两种表型，分别是促炎的M1表型和抗炎/促修复的M2表型[13]。既往观点认为，M1型巨噬细胞能量来源主要依赖于糖酵解，并在三羧酸循环中出现两次断裂，导致琥珀酸和衣康酸的积累。过量的琥珀酸进一步导致糖酵解基因转录的激活，从而诱发了巨噬细胞的代谢重编程。巨噬细胞的代谢重编程则可进一步加速巨噬细胞衰老，同时激活炎性反应[14,15]。既往研究显示，在脓毒症肺损伤发生时，肺组织中糖酵解水平明显升高，同时伴有大量乳酸堆积。而使用2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)抑制糖酵解后可显著减轻脓毒症小鼠肺病理损伤及炎性反应，同时小鼠肺组织中NLRP3炎性小体的激活被明显抑制[5]。本研究发现，白皮杉醇干预可明显降低脓毒症小鼠肺组织中IL-1β、IL-6和TNF-α，同时还抑制了肺组织中的糖酵解水平。

白皮杉醇作为一种多靶点的天然多酚化合物，存在于日常的多种食物中，包括蓝莓、葡萄、百香果和花生。作为白藜芦醇的前体，白皮杉醇同样表现出重要的药理活性，包括抗衰老、抗癌、抗糖尿病、抗炎症、抗肥胖和抗氧化效应[16]。例如，白皮杉醇可通过激活SIRT3/FOXO3a信号通路减轻神经元细胞的线粒体功能障碍，最终抑制神经元凋亡[17]。白皮杉醇还能通过提高谷胱甘肽水平和过氧化氢酶活性，显著减轻四氯化碳诱导的肝氧化性损伤和纤维化[18]。在脓毒症心肌损伤中，白皮杉醇可直接抑制JAK2，改善小鼠心脏功能[19]。既往研究显示，HDAC7可促进巨噬细胞中TLR4依赖的促炎性细胞因子表达并激活炎性反应，且这种效应与HDAC7对巨噬细胞的糖酵解调控有关[6]。本研究表明，白皮杉醇预处理可显著抑制脓毒症小鼠肺组织中HDAC7的蛋白表达，因此推测白皮杉醇对脓毒症小鼠肺组织的糖酵解抑制可能与其对HDAC7蛋白表达下调有关。

综上所述，白皮杉醇可能通过抑制HDAC7介导的糖酵解减轻脓毒症小鼠肺损伤和炎性反应，进而发挥肺保护作用，但白皮杉醇对HDAC7的抑制机制还需要未来进一步探索。