消栓再造丸质量标准提升研究

栾 洁，浦 洁，殷红军

（江苏省无锡市药品安全检验检测中心，江苏 无锡 214028）

消栓再造丸属国家中药保护品种，由血竭、黄芪、天麻、朱砂等38味药材组方，始载于《北京市药品标准》（1983年版），由同仁堂制药厂于1980年研制而成（且为其保密方）。方中血竭（含有血竭素、血竭红素等黄酮类衍生物成分）活血祛瘀通经；天麻平肝熄风，祛痰解痉；黄芪补气行滞。全方具有活血化瘀、熄风通络、补气养血、消血栓功效，临床多用于治疗气虚血滞、风痰阻络引起的中风后遗症（症见肢体偏瘫、半身不遂、口眼喎斜、言语障碍、胸中郁闷等）。其现行质量标准［1］项目设置简单，除【性状】、【检查】项外，仅对制剂中的部分药味进行显微鉴别。为此，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对方中黄芪、天麻进行定性鉴别［2-9］，采用高效液相色谱（HPLC）法测定方中血竭素的含量［10-12］，为制剂的质量标准改进提供参考。现报道如下。

1 仪器与材料

仪器：Waters 2695 型高效液相色谱仪，包括四元低压梯度泵、自动进样器、柱温箱和二极管阵列检测器（美国Waters 公司）；XS205DU 型电子天平、XP-6 型精密电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；ATS 4 型薄层自动点样仪、ADC 2 型全自动展开仪（瑞士CAMAG 公司）；S100H型数控超声波清洗器（德国Elma公司）。

试药：消栓再造丸（北京某药厂，批号分别为16013615，17013437，17013929，17013930，17013964，18013108，18013110，18013437，18013533，18013639）。预制硅胶G 板（100 mm×100 mm，德国Merck 公司）；黄芪甲苷对照品（批号为110781-201717，含量96.9%）、天麻素对照品（批号为110807-201809，含量96.7%）、血竭素高氯酸盐对照品（批号为110811-201707，含量96.3%，血竭素含量=血竭素高氯酸盐的含量/1.377），天麻对照药材（批号为120944-201611），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为自制超纯水。

2 方法与结果

2.1 TLC 鉴别

黄芪：取样品6 g，剪碎，加入40 mL甲醇，水浴加热回流1 h，用滤纸滤过，取滤液浓缩至约10 mL，置中性氧化铝柱（100～120 目，5 g，内径为15 mm）上，用100 mL 40%甲醇洗脱，取洗脱液，蒸干；残渣加30 mL 水使溶解，再用20 mL 水饱和的正丁醇振摇提取2 次，合并正丁醇提取液，再用水洗涤2 次，弃去水液，取正丁醇液，蒸干；残渣加0.5 mL 甲醇使溶解，即得供试品溶液。取黄芪甲苷对照品约5 mg，置5 mL容量瓶中，加甲醇制成1 mg/ mL 的对照品溶液。按消栓再造丸处方和工艺制备缺黄芪的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502［12］，吸取上述3 种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）的下层溶液为展开剂，展开，取出，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光灯及紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置处显相同颜色斑点，且阴性对照无干扰。详见图1。

图1 黄芪薄层色谱图1-3.Test solution 4.Astragaloside Ⅳreference solution 5 Negative reference solutionA.Fluorescent lamp B.Ultraviolet lamp（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms of Astragali Radix

天麻：取样品10 g，剪碎，加等量硅藻土，研匀，称取2 g，加10 mL 70%甲醇超声（功率250 W，频率40 kHz，下同）处理30 min，滤过，取滤液，即得供试品溶液。取天麻素对照品约5 mg，置5 mL 容量瓶中，加甲醇制成1 mg/mL的对照品溶液。取天麻对照药材0.5 g，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按消栓再造丸处方和工艺制备缺天麻的阴性样品，再按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。按2020 年版《中国药典（四部）》通则0502，取上述供试品溶液及阴性对照品溶液各15 μL，对照品溶液5 μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（9∶1∶3，V/V/V）为展开剂，展开，取出，喷以磷钼酸乙醇试液，105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置处显相同颜色斑点，且阴性对照无干扰。详见图2。

图2 天麻薄层色谱图1-3.Test solution 4.Reference medicinal material solution of Gastrodiae Rhizoma 5.Gastrodin reference solution 6.Negative reference solutionFig.2 TLC chromatograms of Gastrodiae Rhizoma

2.2 血竭素含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.05 mol/ L 磷酸二氢钠溶液（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/ min；检测波长：440 nm；柱温：40 ℃；进样量：10 μL。

2.2.2 溶液制备

取血竭素高氯酸盐12.770 mg，精密称定，置25 mL棕色容量瓶中，以10%磷酸甲醇溶液溶解并定容，制成血竭素高氯酸盐质量浓度为0.491 9 mg/mL（血竭素质量浓度为0.357 2 mg/mL）的对照品溶液。取样品10 g，剪碎，精密称定，加入硅藻土10 g，精密称定质量，充分研匀后精密称取4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入25 mL 10%磷酸甲醇溶液，密塞，称定质量，超声处理30 min，水浴回流30 min，放冷至室温，再次称定质量，用10%磷酸甲醇溶液补足缺失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按处方和工艺制备缺血竭的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：取上述对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液色谱在与对照品溶液色谱相同保留时间处有相应色谱峰，且阴性对照无干扰，表明专属性良好。详见图3。

图3 高效液相色谱图1.DracorhodinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.3 HPLC chromatograms

线性关系考察：精密量取2.2.2 项下对照品溶液，以10%磷酸甲醇溶液制成含血竭素1.428 9，3.572 3，7.144 5，35.722 6，71.445 2，178.613 1 μg/mL 的系列对照品溶液。精密量取10 μL，按2.2.1项下色谱条件进样测定。以血竭素质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=2.288×104X-1.263 × 103（r=0.999 9）。结果表明，血竭素质量浓度在1.428 9～178.613 1 μg/mL 范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限考察：分别精密量取对照品溶液适量，倍比稀释，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以信噪比10∶1、3∶1 时的待测成分质量浓度分别记作定量限、检测限。结果血竭素的定量限和检测限分别为0.589 4 μg/mL，0.176 8 μg/mL。

精密度试验：取2.2.2 项下对照品溶液适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定6次，记录峰面积。结果血竭素峰面积的RSD为0.71%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取供试品溶液（批号为17013437）适量，分别于室温下放置0，2，4，8，12 h时按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果血竭素峰面积的RSD为2.70%（n=5），表明供试品溶液在室温放置12 h内基本稳定。

重复性试验：精密称取样品（批号为17013437）适量，各6 份，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算血竭素含量。结果血竭素平均含量为62.04 μg/g，RSD为0.84%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（批号为17013437）适量，共9 份，以当前取样含量的1∶0.5、1∶1、1∶1.5，精密加入2.2.2 项下对照品溶液适量，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

2.2.4 样品含量测定

取10 批样品各适量，按2.2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算含量。结果见表2。

表2 样品含量测定结果（μg/g，n=2）Tab.2 Results of content determination of dracorhodin in the samples（μg/g，n=2）

3 讨论

定性鉴别中，由于样品中含38 味药材且均为原粉入药，故对其制备和展开条件进行了探索。在制备黄芪的供试品溶液时，样品的提取曾尝试用甲醇回流液浓缩直接点样展开，但由于处方中含众多药味，薄层展开时干扰较多，故采用滤液过中性氧化铝柱的方式净化供试品溶液，获得较好的TLC图谱；展开条件的考察中，鉴别黄芪时对不同展开系统［三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10，V/V/V/V）置10 ℃以下的下层溶液、三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）置10 ℃以下的下层溶液、二氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（25∶5∶10∶0.2，V/V/V/V）］、鉴别天麻时对不同展开系统［三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（8∶1∶3∶0.1，V/V/V/V）、三氯甲烷-甲醇（3∶1，V/V）、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇（9∶1∶3，V/V/V）］进行考察，同时对不同厂家薄层板（青岛海洋厂、德国默克公司、德国MN 公司产硅胶G薄层板）、不同温度（8 ℃、25 ℃、30 ℃）、不同相对湿度（32%，52%，65%）进行了考察，结果表明，筛选的薄层色谱条件重现性好，分离效能高，可用于消栓再造丸的定性鉴别。

定量测定中，曾尝试取样品，直接加入不同体积分数的磷酸甲醇溶液提取制备供试品溶液，但因样品中含蜜量较高，直接提取样品易结块，提取效率低，故采用加入硅藻土吸附糖分，使样品容易分散，提高提取效率。在样品制备的过程中，考察了取样量、加入溶剂的体积分数、体积及提取方式。具体为取样品适量，剪碎，加入等量硅藻土，混匀，取约2 g、4 g、6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入不同体积分数（3%，5%，10%，12%）的磷酸甲醇溶液各25 mL 或50 mL，超声处理30 min，放冷，再次称定质量，用相应的溶剂补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液，即得。结果表明，取样量为4 g 时，加10%磷酸甲醇溶液25 mL，供试品中血竭素的提取效果最好；比较了取样量为4 g时，以10%磷酸甲醇溶液为溶剂超声处理30 min、加热回流30 min、先加热回流30 min 再超声处理30 min 的提取效果。结果表明，供试品取样量为4 g，采用10%磷酸甲醇溶液为溶剂，先加热回流30 min再超声处理30 min，血竭素的提取效果最好，可用于测定消栓再造丸中血竭素含量的。

综上所述，所建标准准确、简便、重复性好，可用于完善消栓再造丸的质量标准。