西帕依固龈液治疗糖尿病足溃疡效果及网络药理学分析*

李 茜，郝 梦，李金耀，李建德，刘 婷，季志红

（1.新奇康药业股份有限公司，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830049；3.新疆医科大学第四附属医院，新疆 乌鲁木齐 830054；4.新疆奇沐医药研究院，新疆 乌鲁木齐 830011；5.新疆中药＜民族药＞制药共性关键技术研究重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830011）

糖尿病足溃疡（DFU）为严重的慢性糖尿病并发症，临床主要表现为伴有神经病变和周围血管病变的足部溃疡［1］。DFU 可导致感染、坏疽、截肢，甚至死亡，给患者带来身体痛苦和经济负担。目前主要治疗手段为在控制血糖基础上，清洁护理创面、控制感染、增加血流灌注和足部减压［2］。中医将DFU 归为“脱疽”，多以清热解毒、祛腐排脓、活血散瘀、消痈止痛为治疗原则［3］。西帕依固龈液主要组成药材为没食子，具有清热解毒、化腐消痈、活血逐瘀功效，主要用于治疗牙周疾病引起的牙齿酸软、牙龈出血、口舌生疮，咽喉肿痛等病症［4］。本研究中探讨了西帕依固龈液促进模型大鼠DFU愈合的效果，并结合网络药理学分析其作用机理，为后续研究该制剂治疗DFU的药物效应动力学和机制提供参考，同时为制剂的二次开发探索提供研究基础。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器、试药与动物

仪器：PL2002型分析电子天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司）；EQ2016 -037 型显微镜（德国Leica公司）。

试药：西帕依固龈液（新奇康药业股份有限公司，批号为191021，规格为每瓶100 mL）；链脲佐菌素（STZ，美国西格玛奥德里奇公司，批号为190209）、柠檬酸、柠檬酸三钠均为分析纯；水为纯化水。

动物：SD 大鼠50 只，健康洁净级，雄性，5～7 周龄，体质量（200±20）g，均购自新疆农业大学，实验动物生产许可证号SCXK（新）2018 -0002，伦理批件号2019011。所有大鼠均于无特定病原体环境中饲养，温度（25±2）℃，相对湿度（50±5）%，人工光照12 h/12 h明暗交替，自由进食饮水，适应性喂养1周。

1.2 方法

1.2.1 动物实验

糖尿病模型建立：适应期结束后即称定大鼠体质量，并随机分为空白组（10只）及实验组（40只）。实验组采用饮食诱导+化学试剂诱导的方法建模，给予正常饮食、饮水，灌胃高脂乳剂饲料（每100 g体质量0.6 mL），每天1次，持续饲喂30 d，每5 d记录1次体质量，并观察大鼠形态变化；30 d后腹腔注射1%STZ溶液（60 mg/ kg），连续注射3 d后，禁食12 h，于次日清晨对实验组大鼠尾尖部针刺采血，使用血糖仪和试纸测量血糖，连续2 次血糖＞16.7 mmol/L即为糖尿病大鼠模型复制成功。

DFU 模型建立：取糖尿病模型大鼠，对其左踝关节周围1.5 cm 范围脱毛，后期用药阶段中每3 d 重复脱毛1 次，用棉签蘸取饱和氢氧化钠溶液涂抹于裸露皮肤持续30 s后，用生理盐水和清水多次反复清洗以建立足部溃疡模型。涂抹氢氧化钠时，注意控制涂抹面积大致相当且均匀，建模成功后，记录大鼠初始溃疡面积，并每7 d 记录1 次溃疡愈合情况。此期间给予所有大鼠正常饮食、饮水，不给予其他处理。

分组及给药：将实验组26只DFU模型大鼠随机分为模型组和给药组，各13只。模型组大鼠2次血糖平均值分别为（18.4±3.4）mmol/L、（18.3±3.4）mmol/L，给药组分别为（18.5±3.4）mmol/L、（20.0±3.3）mmol/L。给药组大鼠溃疡区域冲洗涂抹西帕依固龈液，每只2 mL，早晚各1次，先彻底冲洗溃疡面，再用棉签拭去多余液体。每次给药后以无菌纱布覆盖并固定。模型组及空白组大鼠给予等体积生理盐水。连续给药14 d。

检测指标：于治疗第1，7，15 天采用计算机像素点法测量溃疡面积，计算溃疡面抑制率。溃疡抑制率（%）=（模型组大鼠溃疡面积-给药组大鼠溃疡面积）/模型组大鼠溃疡面积×100%。对大鼠腹主动脉采血，取血清，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测表皮生长因子（EGF）水平。取大鼠溃疡部位组织，固定于10%中性甲醛溶液中，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、苏木素-伊红（HE）染色、封片后，显微镜下观察组织形态并摄片。

统计学处理：采用SPSS 20.0 统计学软件分析。计量资料以表示，行t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

1.2.2 网络药理学

化学成分及靶点获取：以“没食子”为检索词，在中国知网、万方医学网以及Geen Medical 等平台获取相关文献，总结整理没食子化学成分；将成分导入中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，https：// tcmspw.com/ tcmsp.php），设置口服生物利用度（OB）≥30%进行筛选。根据现有文献报道补充没食子酸乙酯（OB=25.61%），建立西帕依固龈液的成分数据库；通过TCMSP 获取成分的靶点，运用Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）下载靶点标准名称文件，对靶点进行标准化处理，构建西帕依固龈液的靶点数据库。

疾病靶点获取：以“Diabetic foot ulcer”为关键词，分别检索药物数据库（DrugBank，https：// go.drugbank.com/）、人类基因组数据库（GeneCards，https：// www.genecards.org/）、人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：// omim.org/）、治疗靶点数据库（TTD，https：//go.drugbank.com/）获取DFU 相关靶点，去重后构建DFU的靶点数据库。

交集靶点获取：利用R 语言3.6.1 软件，整理前述2个靶点数据库文件，获取二者的交集靶点。

“成分-靶点”网络构建：将交集靶点、药物-成分关系、成分-靶点关系相关数据导入Cytoscape 3.8.0软件，构建“成分-靶点”网络。成分及靶点的形状大小反映Degree值大小。

蛋白质相互作用（PPI）网络构建及分析：利用String数据库（https：// string -db.org/），选择“Multiple proteins”，导入交集靶点文件相关数据，物种选择“Homo sapiens”，参数设置为“最低要求评分0.4分”“删除游离节点”，获取PPI 网络图。将PPI 网络关系相关数据导入Cytoscape 3.8.0 软件，以“Degree centrality，DC”“Closeness centrality，CC”“Betweenness centrality，BC”“Eigenvector centrality，EC”“Network centrality，NC”“localaverage Connectivity，LAC”为筛选条件，选取以上6个拓扑特征值均大于其相应中位数的靶点作为核心靶点，进行2轮分析，构建PPI拓扑分析图。

富集分析：利用R 语言3.6.1 软件的“dose bioconductor”“clusterprofiler bioconductor”“enrichplot bioconductor”“pathview bioconductor”包，对交集靶点进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，设定显著性条件为q.adjust ＜0.05，筛选显著的生物功能和信号通路，并制作气泡图和条形图。

分子对接验证：将“成分-靶点”网络与PPI中Degree值排名前3的成分与靶点进行对接。从PubChem 数据库（https：// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下载配体文件，利用Chem3D 软件对配体进行能量最小化处理。从蛋白质结构数据库（PDB，http：//www1.rcsb.org/）中下载受体结构文件，利用PyMOL 对受体进行去水和除杂等处理；通过AutoDockTools 1.5.6软件确定配体、受体结合的活性口袋相关参数，并进行半柔性分子对接。借助PyMOL绘制最佳对接模型图。结合能小于0 kcal/mol表明配体能和受体自发结合，结合能越小对接越好。小于-5.0 kcal/mol，表明结合性较好。

2 结果

2.1 动物实验

大鼠一般情况：大鼠体质量变化情况见表1。实验期间空白组大鼠体质量持续升高，给药组和模型组大鼠仅在前期饮食诱导期间升高。在糖尿病模型复制成功后，大鼠皆出现典型的“三多一少”症状。且大鼠表观毛色偏黄，暗淡无光泽，并有精神萎靡表现，其中1只大鼠出现厌食等抑郁相关症状。实验结束后，给药组大鼠溃疡面出现修复状态，溃疡颜色变淡，且未出现扩大现象；模型组大鼠溃疡颜色较深，其中个别溃疡面扩大。

表1 大鼠体质量变化情况（，g）Tab.1 Changes of body mass in rats（，g）

表1 大鼠体质量变化情况（，g）Tab.1 Changes of body mass in rats（，g）

检测指标：给药7 d 及15 d 后给药组大鼠溃疡面积明显小于模型组（P＜0.05），见表2。给药15 d时给药组大鼠溃疡抑制率为58.38%。与空白组比较，模型组EGF水平显著降低［（558.13 ± 87.84）pg/ mL 比（666.13 ±134.21）pg/mL，P＜0.05］；与模型组比较，给药组EGF水平显著升高［（638.82± 154.54）pg/mL 比（558.13 ±87.84）pg/mL，P＜0.05］。

表2 给药后大鼠溃疡面积比较（，mm2，n=13）Tab.2 Comparison of ulcer area of rats after administration（，mm2，n=13）

表2 给药后大鼠溃疡面积比较（，mm2，n=13）Tab.2 Comparison of ulcer area of rats after administration（，mm2，n=13）

注：与模型组比较，*P ＜0.05。Note：Compared with those in the model group，*P ＜0.05.

组织病理情况：结果见图1。空白组大鼠溃疡组织可见毛囊腺体下有脂肪组织，无修复，毛囊及表皮完整。模型组可见组织间有水肿，脂肪细胞少；有经修复形成的角质化新的凹凸面，溃疡面大；溃疡区域未见毛囊再生。给药组可见溃疡后的修复，毛囊再生过程不完善，且脂肪细胞较模型组增多。

图1 大鼠组织病理学观察（HE，×200）A1，A2.Blank group B1，B2.Model group C1，C2.Administration groupFig.1 Histopathological observation of rats（HE，×200）

2.2 网络药理学

2.2.1 化学成分及靶点筛选

通过文献挖掘及后续筛选，获得西帕依固龈液化学成分7个；作用靶点54个，去重后得40个。结果见表3。分别从DrugBank，GeneCards，OMIM，TTD 数据库中获得DFU 作用靶点2 391，170，15，3 个，去重后共得靶点2 429 个。取交集共得到29 个靶点，详见表4。

表3 西帕依固龈液化学成分及靶点数量Tab.3 Chemical composition and number of targets of Xipayi Mouth Rinse

表4 西帕依固龈液-DFU交集靶点Tab.4 Intersection targets of Xipayi Mouth Rinse -DFU

2.2.2 网络构建

“成分-靶点”网络：29个交集靶点与7个活性成分匹配后，最终得到6 个具有抗DFU 作用的活性成分，分别为鞣花酸（MOL001002）、没食子酸（MOL000513）、没食子酸甲酯（MOL001906）、没食子酸乙酯（MOL001907）、丁香酸（MOL001807）、间双没食子酸（MOL000569），结果见图2。

图2 西帕依固龈液-DFU“成分-靶点”网络Fig.2 ″Component-Target″ network of Xipayi Mouth Rinse-DFU

交集靶点PPI 网络：29 个交集靶点的PPI 网络包括29 个节点，140 条边，平均Degree 值9.66，PPI 富集P值＜1.0×10-16；将该网络关系导入Cytoscape 3.8.0软件进行拓扑分析，第一轮筛选阈值为BC ≥6.677 777 778，CC ≥0.346 590 909，DC ≥9，EC ≥0.346 590 909，LAC ≥6.888 888 889，NC ≥7.75，共获得9个中心节点。详见图3。

图3 PPI拓扑分析图Fig.3 PPI topological graph

2.2.3 富集分析

GO 功能富集：共得到1 240（q.value ＜0.05）个条目，包括生物过程（BP）1 094 条，分子功能（MF）127 条，细胞组分（CC）19 条；可视化处理各部分注释结果的前10条，结果见图4。西帕依固龈液治疗DFU的靶点，主要参与调节对脂多糖、类固醇激素、细菌来源分子反应等过程的调控；作用主要体现在酰胺结合、RNA 聚合酶Ⅱ一般转录起始因子结合、肽结合等方面；主要集中于调控细胞质囊泡腔、囊泡腔、小窝等部位。

图4 西帕依固龈液-DFU的GO功能富集可视化分析Fig.4 Visualization analysis of GO function enrichment of Xipayi Mouth Rinse-DFU

KEGG 通路富集：共得到124 条（q.value ＜0.05）信号通路，将前30条通路进行可视化处理，结果见图5。主要涉及前列腺癌、铂类耐药、乙型肝炎、人类巨细胞病毒感染、癌症中的蛋白多糖、膀胱癌、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、流体剪切应力和动脉粥样硬化、小细胞肺癌、IL-17 信号通路等。提示西帕依固龈液可能通过调节多个通路发挥治疗DFU的作用。

图5 西帕依固龈液-DFU的KEGG通路富集可视化分析Fig.5 Visualization analysis of KEGG pathway enrichment of Xipayi Mouth Rinse-DFU

2.2.4 分子对接

鞣花酸、没食子酸、没食子酸甲酯分别与细胞肿瘤抗原（TP53）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、半胱氨酸蛋白酶-3（CASP3）进行分子对接，结合能均小于0 kcal/mol。分子对接结果见表5及图6至图8。

表5 核心成分与核心靶点的分子对接结果Tab.6 Results of molecular docking between key components and key targets

图6 鞣花酸-核心靶点的分子对接结构图A.Ellagic acid-TP53 B.Ellagic acid-VEGFA C.Ellagic acid-CASP3Fig.6 Molecular docking structure of ellagic acid-key targets

图7 没食子酸-核心靶点的分子对接结构图A.Gallic acid-TP53 B.Gallic acid-VEGFA C.Gallic acid-CASP3Fig.7 Molecular docking structure of gallic acid-key targets

图8 没食子酸甲酯-核心靶点的分子对接结构图A.Methyl gallate-TP53 B.Methyl gallate-VEGFA C.Methyl gallate-CASP3Fig.8 Molecular docking structure of methyl gallate-key targets

3 讨论

DFU 多种病因共存，目前尚未完全阐明其发病机制。目前普遍认为其主要与足周围神经病变、血管病变及足部感染有关。DFU 发生的主要危险因素之一是足周围神经病变，其主要累及感觉神经、运动神经和自主神经，尤其末梢神经病变。血管病变亦是影响DFU 预后的重要因素之一，其中包括微血管病变和大血管病变。动脉粥样硬化是大血管病变的主要病理改变，多数学者考虑DFU 的主要发病机制之一是下肢动脉硬化。感染是DFU 的发生并趋于加重的重要原因之一，其增加局部耗氧及促凝物质产生，加重缺血，从而加重坏疽［5］。

测量DFU 模型大鼠溃疡面积采用计算机像素点法（以中国人民银行1角硬币为参照物）。于电脑绘图工具中分别圈索出溃疡区域与硬币区域，记录像素点。以溃疡区域像素点和硬币像素点的比值乘以硬币的面积，即得大鼠足部溃疡区域的面积。溃疡创面的愈合是创面修复的过程。脂肪细胞对创面修复有重要作用，能分泌合成转化生长因子1、血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子-α、骨形成蛋白等60 多种蛋白［6］，从而促进表皮细胞的增殖和分化，进而形成良好的表皮层结构。毛囊与皮肤创面的修复及瘢痕的形成具有密切关系，其再生程度可反映溃疡创伤深部及表层的修复情况。关于毛囊与创伤修复的研究证实，毛囊单位可有效促进创面愈合［7-8］。

有研究表明，EGF 可增加DFU 患者伤口处的胶原含量，促进肉芽组织快速形成，有利于伤口的愈合。本研究中也发现，西帕依固龈液可显著增加DFU 模型大鼠的EGF水平，促进创面愈合［9-12］。

没食子作为西帕依固龈液主要组成药材，其主要活性成分为没食子酸、鞣花酸等成分，具有固涩、收敛、燥湿、止血、消炎等功效［13］。成分-靶点网络显示，西帕依固龈液抗DFU 的核心成分可能是鞣花酸、没食子酸等。鞣花酸属鞣质类成分，具有抗炎、抗氧化、抗菌、降糖、调脂作用［14-16］。没食子酸具有显著的抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等作用，对心血管系统疾病、神经系统疾病、糖尿病、肝纤维化和肿瘤等具有防治作用［17-18］。PPI 网络显示，TP53，VEGFA，CASP3 等为核心靶点。TP53 具有调控细胞分裂和增殖的作用。VEGFA 在血管的生成和发生及内皮细胞生长中有重要作用，可诱导内皮细胞增殖、促进细胞迁移、抑制凋亡并诱导血管通透性，对生理和病理性血管生成均必需。CASP3 在细胞凋亡的执行阶段起关键作用，与癌症的发生、衰老、心血管疾病的发生等有重要联系。KEGG 富集分析显示，PI3K-Akt、NF-κB信号通路等为核心通路。PI3K/Akt信号通路可介导多种细胞信号传递并调节细胞自噬、增殖、转录、翻译等多个过程［19］。PI3K-Akt-mTOR 信号通路有独立的激活剂，介导内皮细胞迁移、促进新生血管形成，从而促进DFU 愈合［20］。细胞外囊泡是PI3KAkt-mTOR信号通路的激活剂之一，可通过激活PI3KAkt-mTOR通路，加速血管内皮细胞的迁移，增加伤口的血管密度，从而促进糖尿病小鼠的创面愈合［21-22］。NF-κB是一种异源性二聚体，它不仅与慢性低度炎症相关还与糖尿病等代谢性疾病相关。DFU创面愈合可由JNK-NFκB-NLRP3信号通路介导，NF-κB、NLRP3活化时可使糖尿病创面的炎症细胞浸润，延长炎症持续状态，减慢糖尿病创面的愈合速度［19］。

综上所述，西帕依固龈液可通过减少足部溃疡面积，增加病灶组织的脂肪细胞和再生毛囊数量，发挥抗大鼠DFU作用。其作用机制可能与西帕依固龈液中鞣花酸、没食子酸等核心成分作用于TP53，VEGFA，CASP3等核心靶点，继而影响PI3K-Akt、NF-κB 等信号通路有关。本研究为后续西帕依固龈液治疗DFU的药物效应动力学及机制研究奠定了基础，并为西帕依固龈液二次开发利用研究提供参考依据。