超微粉碎对牛蒡根粉多酚及抗氧化活性的影响

陈元震， 胡昕迪， 方旭波， 黄午阳， 李 莹， 陈小娥

(1.浙江海洋大学食品与药学专业，浙江舟山 316022； 2.江苏省农业科学院，江苏南京 210014)

自然界植物中含有丰富的酚类物质，天然酚酸通常以游离态和结合态存在于植物的皮、根、木、叶和果实中[1]。大量试验数据证明，植物中的酚类物质具有多种生物活性，在抗氧化、抗菌、抗虫、抗病毒等方面发挥着重要作用。这类化合物包括黄酮类化合物和羟基肉桂酸等，牛蒡是这2种化合物的重要天然来源。牛蒡(ArctiumlappaL.)别称牛蒡子(burdock)，是桔梗目菊科二年生草本植物，在亚洲已有3 000多年种植历史。因具有保肝、抗炎和抗氧化的潜在治疗特性而被作为一种营养和功能食品广泛推广[2]。与市面上使用的灵芝、人参等名贵药材相比，牛蒡不仅具有多种食用和治疗价值，且价格低廉易于栽培[3]。目前，在我国牛蒡根主要以菜品的形式在餐桌上呈现。为加大牛蒡的开发利用度，我们可将牛蒡根深加工制成粉末，添加到各种食品中作为功能性食品补充剂。物料利用程度和粉体理化性质密切相关，不同的生产工艺对原料的理化性质和生物活性有重要影响，粉碎工艺对粉体的特性和粒度起到关键作用。

超微粉碎技术是近年来一种新兴的加工技术，通常被应用于生物技术、制药工业和食品加工等领域。与传统制备技术相比，超微粉碎技术具有更大的潜力和发展空间[4]。在加工特性方面，由于物料在短时间内被强烈粉碎，超微粉的表面发生变化，导致微粉显现出一些粗颗粒所不具有的特性，这种特性主要表现为高溶解性、高分散性、高吸附性和高流动性[5]。在化学组成方面，超微粉碎技术提高了植物细胞壁的破碎程度，有利于存在于细胞质和细胞核的有效活性成分溶出，增加了活性物质提取效率、抗氧化性能和生物利用度[6]。此外，超微粉碎对物料物理特性，如热力学性质、结晶度、官能团变化等也有一定影响[7]。由此可见，超微粉碎适合于方便食品和速食食品的生产。

超微粉碎技术对牛蒡根粉的影响尚未见报道。因此，本研究旨在比较超细研磨和普通粉碎后，6种不同粒径牛蒡根粉在颗粒特征、多酚含量、抗氧化活性及生物利用度方面的区别，以期为牛蒡根粉在速食食品和有效药物成分的应用中提供数据参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛蒡根，购自江苏省丰县。氢氧化钠、氯化钾、磷酸钾、碳酸氢钠、没食子酸、福林酚等为分析纯试剂，购自百灵威化学试剂有限公司。浓硫酸、盐酸、乙酸乙酯、甲醇等为分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。1，1-二苯基-2-苦基肼基(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)、2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、2，4，6-三(2-吡啶基)1，3，5-三嗪[2，4，6-tri(2-pyridyl)1，3，5-triazine，TPTZ]，均购自默克生物科技有限公司。6-羟基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)，购自美国Across Organics公司。胃蛋白酶、黏膜蛋白、猪胆盐、胰蛋白酶，均购自上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

XDW-6A振动式细胞级超微粉碎机，购自济南达微机械有限公司；L3-5K台式低速离心机，购自湖南可成仪器设备有限公司；RE-52AA型真空减压旋转蒸发仪、SHZ-Ⅲ型循环水真空泵，购自上海亚荣生化仪器厂；KQ-400DE数控超声波清洗机，购自昆山市超声仪器有限公司；FDU-1200真空冷冻干燥机，购自东京理化器械株式会社；AL104电子分析天平，购自梅特勒托利多科技(中国)有限公司；PHS-2C pH计，购自上海智光仪器仪表有限公司；UV-6100紫外分光光度计，购自上海美普达仪器有限公司；EUROSTAR 40 Digital高速搅拌器，购自德国IKA公司；Avanti J-26S XP落地式高速冷冻离心机，购自美国Beckman Coulter公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理 选择大小均匀、无机械损伤和病虫害的牛蒡根(采自江苏省徐州市沛县，34°43′N、116°56′E)。将新鲜牛蒡洗净，切成 1～2 cm厚薄片，60 ℃热风干燥成牛蒡干。将牛蒡干分为2个部分，一部分使用超微粉碎机进行超细研磨，另一部分使用实验室常用的普通研磨机研磨，具体方法见表1，两种研磨方式得到6种牛蒡根粉。由于牛蒡根粉在空气中易吸水结块、褐变，需远离潮湿和光线，存放在密封袋，存于4 ℃冰箱。

表1 牛蒡干制备方法

1.3.2 粒径分布 粒径分布采用干式激光衍射仪在室温下进行测量。将1 g牛蒡根粉加入盛有 50 mL 水的烧杯中，搅拌均匀后，放入粒径仪中进行粒径分布测定。其中，D10、D50、D90分别代表小于粉末粒径的10%、50%、90%的粒径累积百分位数，D(3，2)、D(4，3)、D(2，1)和D(1，0)分别表示面积平均径、体积平均径、长度平均径和数量平均径。Span表示牛蒡根粉末粒径的分布宽度，Φ表示细胞壁破裂率(当D50<10 μm 时，Φ=1)，以此来表征颗粒大小分布[8]，计算公式如下所示：

(1)

(2)

1.3.3 游离态、结合态酚类物质的提取 参考Juániz等的提取方法[9]，从不同粒径的牛蒡根粉中提取游离态多酚。先采用80%甲醇提取3次，后采用6 mol/L盐酸将上清样品的pH值调至2.0，经乙酸乙酯重复萃取后，将萃取相在旋转蒸发真空下浓缩干燥，甲醇复溶即得游离态多酚。保存剩下的残渣，进行后续分析。

参考罗舜菁等的方法[10]，收集提取过游离酚后的剩余残渣，采用2 mol/L NaOH溶液充分溶解，同时充入N2，室温避光振荡4 h后，采用6 mol/L HCl溶液将pH值调至2.0，离心取上清，加入等量乙酸乙酯萃取分离，重复操作5次，合并上清液在45 ℃条件下旋蒸，最后采用甲醇定容至10 mL，得到结合态多酚，-18 ℃保存。

1.3.4 酚类物质含量的测定 参考Apea-Bah等建立的Folin-Ciocalteu法[11]，稍加修改后测定总酚含量。将40 μL福林酚试剂(25%)与20 μL不同浓度梯度的没食子酸标准品溶液(r=0.999)、空白溶液及多酚提取物溶液混合均匀，随后加入140 μL(700 mmol/L)碳酸钠溶液，得到200 μL混合物。并在恒温摇床上以200 r/min的速度振荡3 min使其混合均匀，室温孵育30 min，在765 nm处测定吸光度。结果以1 g干物质中所含没食子酸当量(mg GAE/g)表示。

1.3.5 体外抗氧化能力的测定 DPPH 自由基清除能力测定根据Cheng等的报道[12]，略有改变。将10 μL标准品溶液、酚类物质提取液和空白溶液分别与190 μL浓度为 65 μmol/L 的DPPH自由基溶液混合在96孔板中，在摇床上以100 r/min混匀 1 min，避光孵育 30 min 后，在517 nm处测定吸光度。DPPH自由基清除能力按1 g干物质中所含Trolox当量(mg TE/g)表示。

ABTS自由基清除能力的测定基于杨灵光报导的方法[13]，略有变化，准备1个自由基备用溶液(7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8)，并在室温下保持12～16 h，使用前用甲醇溶液在734 nm处调整备用溶液的吸光度范围为0.70±0.02，将5 μL样品和195 μL ABTS溶液混合孵育6 min，在 734 nm 处读值。ABTS自由基清除能力按1 g干物质中所含Trolox当量(mg TE/g)表示。

铁离子还原能力测定。对铁离子还原能力的分析参考Benzie等的方法[14]，将浓度为0.3 mol/L的醋酸钠缓冲液(pH值3.6)、10 mmol/L的TPTZ溶液(由40 mmol/L HCl溶解)和20 mmol/L的氯化铁溶液按1 ∶1 ∶10的体积比充分混匀，水浴加热至 37 ℃，得到FRAP溶液。将1 mL样品加入至5 mL新鲜的FRAP溶液中，然后将混合物避光置于37 ℃的恒温水域，20 min后取出，在593 nm处读值。铁离子还原能力以1 g干物质中所含FRAP当量(mg FEAC/g)表示。

1.3.6 体外模拟口腔、胃、肠消化 体外消化模拟是由Dong等的方法[15]进行修改而成。粉末的体外消化一般经过三步，开始于口腔，接着是胃，最后是肠道阶段。模拟的唾液、胃液和肠液是由相应的消化酶、水、电解液等配制而成。在口服阶段，将1 g牛蒡根粉末按照1 g ∶5 mL比例与水、氯化钠、氯化钾、柠檬酸钾、尿素和黏膜蛋白等混合，用1 mol/L HCl将混合物酸化至6.8，并在37 ℃水浴中搅拌 10 min，离心取上清液，-20 ℃储存；在胃步骤中，将口腔食糜与水、CaCl2和猪胃蛋白酶混合，用 3 mol/L HCl将混合物的pH值降至3.0，然后孵育搅拌2 h，离心取上清液，-20 ℃储存；在肠道步骤中，将胃食糜与水、CaCl2、胆汁液和胰蛋白酶混合，加入1 mol/L NaOH，将混合物的pH值提高至7.0，搅拌2 h。相同的消化条件下，加入空白组(不含牛蒡根粉)，以纠正消化液、酶和液体的干扰。

1.3.7 多酚化合物的体外释放度 参考李梦杰等的方法计算牛蒡根多酚(BRPP)的生物可及性，消化后酚类物质的生物可及性按公式(3)计算：

(3)

式中：ADS为消化后的样品量；UNS为BRF未消化的样品量。

1.4 数据处理与分析

本研究中每个试验均重复进行3 次，采用Microsoft Excel 2019统计数据、SPSS 25.0分析数据差异的显著性，P<0.05表示差异显著；用Origin 2019 软件作图，结果表示为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 粒度分析

大小在0.000 001～100 mm间的微小固体颗粒被划分为超细粉，颗粒工艺学认为从颗粒系统的角度描述食品粉末的基本特性是进行其他研究的基础[16]。本研究先从粒径分布方面对牛蒡根粉进行初步探讨，粒度分布通常是指粉末样品中不同粒径颗粒在颗粒总量中的占比，采用激光粒径分析仪得到不同研磨时间的牛蒡根粉粒径。由图1可知，粒径分布随着研磨时间增长更为集中，为进一步了解粒径分布，我们总结了6个样品的D10、D50、D90。由表2可知，经超微粉碎的牛蒡根粉的粒径远小于经普通研磨的牛蒡根粉，且超微粉碎后粉末的粒径随着研磨时间的增加而减小，BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-5和BP-6的D90粒径分别为14.16、48.60、98.18、133.70、168.00、360.10 μm，同时粉末的D10、D50、D(3，2)、D(4，3)、D(2，1)、D(1，0)均有与之相同的变化趋势。

表2 牛蒡根粉的粒径参数

跨度值(Span)、Φ和比表面积亦可以反映粉末的基本特性，由表3可知，Span表示粒径分布的宽度，是描述粒径分布的另一个重要参数，Span越小，表示粒径分布均匀[17]。与其他粉末相比，BP-1的Span为2.42，数值最小，说明颗粒更加均匀，且 BP-1 的粒径分布范围比其他粉末更接近于高斯分布，但从总体上看，6种样品的跨度值无明显规律，说明超微粉碎虽可以减小粉末粒度值，但在未达到一定的粉碎时间时，部分颗粒粉碎不够均匀，Span与粒径无关，只能反映颗粒的均一性[18]；另一方面Φ随粒径减小而增加最高可达1.9，说明超微粉碎可破坏牛蒡根的细胞壁，增加活性物质的溶出；此外，比表面积是超细粉体的重要表征指标之一，随着粒径的减小，牛蒡根粉的比表面积从 79.54 m2/kg 迅速增加至593.7 m2/kg，BP-1的比表面积是BP-6的7.46倍，说明超微粉碎对食品粉末的表面性能有显著影响，此结果对粉末的吸附能力、水合作用、溶解度、抗氧化活性、生物利用度等其他性能的研究奠定了基础[7]。

表3 牛蒡根粉末的基本特征

2.2 超微粉碎对BRPP含量的影响

酚类化合物主要以结合态和游离态2种形式存在于牛蒡根中，结合酚常规提取不易溶解，且咀嚼、酸性环境和消化酶都不会使其从食物基质中显著释放出来[19]，因此多数学者忽略了结合酚部分。Kroon等已证明结合酚受到结肠微生物菌群的广泛转化，会表现出抗氧化和抗增殖等活性[20]。本研究主要探索经超微粉碎后游离酚、结合酚和总酚的含量变化。由表4可知，超微粉碎后6种粉末的游离酚、结合酚和总酚的含量均随着粒径的减小而显著增大(P<0.05)，与BP-6相比，BP-1中游离酚、结合酚和总酚的含量增加最为明显，分别增加了23.47%、30.26%、24.87%。超微粉碎加工技术明显增加了牛蒡根中不同状态BRPP的溶出率和释放量，赵萌萌等报道的超微粉碎对青稞麸皮粉末中酚类物质含量的影响中也得到相似结论[21]。一方面随着粒径的减小，Φ增加，牛蒡根的细胞壁遭到破坏，降低对传质的阻力，提高溶剂输注效率，同时改变纤维结构，释放或暴露基质中结合态多酚[17，22]；另一方面，粉末的比表面积增大，这增大了提取溶剂和粉末的接触面积，使提取速率增高，提取量增大。但卫子颜等的研究表明，随着粒径的减小，米糠结合酚的含量出现先增加后减小的趋势，这可能随着超微粉碎时间的增加，剧烈的机械化作用和热效应致使细胞壁间的共价键和非共价键断裂，从而导致结合酚含量损失[23]。而本研究超微粉碎过程采用循环冷水降温模式，且控制超微粉碎时间低于30 min，所以并未出现结合酚含量降低的情况。

表4 超微粉碎处理后的牛蒡根中酚类物质含量

2.3 超微粉碎处理对BRPP抗氧化活性的影响

考虑到研磨过程中酚类各组分化合物的变化，深入评价超微粉碎后BRPP的生物活性尤为重要。对一种物质抗氧化活性的综合评价需要2种或2种以上的分析方法[24]。本研究采用DPPH、ABTS和FRAP清除试验来分析牛蒡根酚类提取物的活性，由图2可知，在3种抗氧化评价体系中，6种不同粒径BRPP均有明显抗氧化活性，且与粒径的大小有显著关系(P<0.05)。结合态和游离态多酚的抗氧化性均随牛蒡根粉粒度的减小而逐渐增大，其中，BP-1的粒径最小，清除自由基的能力也最高，相较于BP-6，BP-1中游离酚和结合酚的DPPH自由基清除力分别提高28.07%、22.15%；ABTS自由基清除力分别提高了36.78%、32.42%；铁离子还原能力也分别提高34.31%、27.13%。叶秋莹等在分析超微粉碎对红茶粉抗氧化性能的影响时也得到相似趋势[25]；究其原因，一方面天然植物的抗氧化能力在很大程度上取决于植物化合物的有效性[17]，超微粉碎使得多酚释放增强，提取率增加，从而增强了超细粉的抗氧化能力；另一方面，高比表面积微观结构导致水溶性增加，提高了粉末的溶解能力，致使水溶性化合物的溶出率增加，如易溶于水的多糖类物质，这间接促进了超细粉抗氧化活性的增强。这与Zhang等的研究结论[17]相符合。由此可见，超微粉碎可应用于大规模加工与牛蒡根相关的功能性食品。

2.4 BRPP含量与抗氧化活性之间的相关性分析

BRPP含量和抗氧化性均随着粒径的减小而增大，为进一步明确BRPP含量与抗氧化活性的关联，分析了各变量间的相关性。由表5可知，BRPP的含量与3种抗氧化活性评价指标呈极显著正相关(P<0.01)，游离酚的相关系数分别为0.994、0.996、0.994，结合酚的相关系数分别为0.975、0.960、0.985，即BRPP含量越高，其自由基清除能力越强。BRPP具有抗氧化活性，直接说明其含有丰富的抗氧化活性化合物。

表5 牛蒡根中酚类物质含量与体外抗氧化活性的相关性分析

2.5 体外模拟胃肠消化过程中牛蒡总酚的含量及释放度

酚类物质的吸收利用率与多种因素有关，食品加工方式对食品结构进行修饰，这会对植物次生代谢物的释放、吸收和转化等产生影响[26]。由于结合酚不能在消化中溶出，本研究主要探索超微粉碎对经消化后游离酚的含量和生物利用率的影响。由表6可知，牛蒡根中多酚含量在口腔、胃、肠中呈现出先增大后减小的趋势，这与Herrera-Balandrano等研究的消化对牛蒡根酚类物质的变化趋势[27]相一致。胃消化阶段酚类物质明显升高，说明较低的pH值环境容易使牛蒡根中酚类物质与碳水化合物、蛋白和多糖形成的稳定复合物分离[28]；肠消化阶段酚类物质含量发生下降，说明采用酶进行的消化模型会对酚类物质造成破坏；进一步分析超微粉碎对BRPP生物可及性的结果发现，对比不同粒径粉末的同一消化阶段，BRPP的含量都随着粒径的减小而显著增加(P<0.05)，BP-1～BP-5计算得到的BRPP生物可接受率较BP-6分别提高20.08%、17.75%、13.84%、9.81%和8.01%，说明超微粉碎可减弱细胞壁的物理阻隔、打破食物基质的结合，有效提高BRPP的生物利用率。

表6 体外口腔胃肠消化后牛蒡根中酚类物质的释放

3 结论

本试验采用超微粉碎技术和普通粉碎技术制备牛蒡根粉，研究了不同粒径对牛蒡根粉模拟消化前后多酚含量和其抗氧化活性的影响。结果表明，超微粉碎的粒径随时间增加显著降低，当时间为 30 min 时，粒径最小，为14.16 μm，此时牛蒡根粉的酚类物质含量最多、抗氧化活性最强，生物利用度最高，此外酚类含量和其抗氧化活性呈显著正相关，表明超微粉碎后的粉末的化学性能更好，当与其他粉末添加剂混合时，具有更高的潜力，发挥最大的作用。