内蒙古通辽地区犊牛腹泻大肠埃希菌毒力基因检测及耐药性分析

杨斯琴，王平，查干哈斯，石顺利

1.内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古 通辽 028000；2.通辽京缘种牛繁育有限责任公司，内蒙古 通辽 028000；3.通辽市农牧科学研究所，内蒙古 通辽 028000；4.通辽市畜牧业发展中心，内蒙古 通辽 028000

大肠埃希菌（E.coli）是人和动物肠道菌群的重要组成部分，通常对宿主无害，但也可能是潜在的致病因子［1］。某些E. coli对人和动物具有致病性，称为致病性E.coli，是人兽共患病的病原菌之一，可引起大肠埃希菌病，从而使宿主免疫功能减弱或造成养殖业重大经济损失［2］。致病性E.coli主要以家畜、家禽及其制品为主要传播载体，可引起人类食物中毒、泌尿道感染、脑膜炎和败血症，甚至导致死亡［3］。

根据 CLERMONT 等［4］建立的分群方法，可将E.coli分为A、B1、B2 和D 4 个系统群。研究表明，在肠外E. coli中 B2 系统群占优势［5］。另一项研究表明，B2 和D 系统群的菌株比A 和B1系统群的菌株具有更多与肠外致病性E. coli（extraintestinal pathogenicE. coli，ExPEC）相关的毒力基因［6］。此外，E. coli的致病性与其携带的毒力基因存在一定的相关性。目前，在牛源致病性E.coli中发现了多种毒力基因，如黏附素、编码血凝素、铁摄取系统、毒素及黏附蛋白等［7］。因此，毒力基因的检测可对E.coli潜在的致病性做出前瞻性判定。

临床上，大肠埃希菌病的治疗以抗菌药物为主。抗菌药物的使用大大提高了动物的生产能力，但随着抗菌药物在畜牧业中的过度使用，其益处已被E. coli日趋严重的耐药性及多重耐药现象削弱，严重影响了畜牧业的健康发展，同时对畜产品和公共卫生安全造成极大的危害［8］。有研究表明，动物可通过食物链或直接接触传播耐药性，如动物源耐药基因可通过食物链传给人类或扩散至环境中［9］。因此，E. coli耐药水平的增加间接给人类健康带来威胁。本研究对内蒙古通辽地区犊牛腹泻病例分离鉴定出的82 株致病性E. coli进行了系统发育分群及13 种抗菌药物的敏感性测定，并采用PCR 技术检测了13 种毒力基因携带情况及12 种耐药基因的分布情况，以期为内蒙古通辽地区犊牛大肠埃希菌病的防控和临床用药提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 菌株 82 株致病性E. coli分离自内蒙古通辽周边规模化奶牛场腹泻犊牛病例粪便样品。

1.2 主要试剂 营养琼脂培养基和营养肉汤购自北京奥博星生物技术有限公司；琼脂糖、2 × Tap PCR MasterMix、核酸染料、细菌基因组DNA 提取试剂盒、DL2000 DNA marker 购自天根生化科技（北京）有限公司；药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 药敏试验 参照临床实验室标准化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）［10］标准，采用纸片扩散法（K-B 法）对82 株致病性E.coli进行13 种抗菌药物敏感性试验。选用E.coliATCC25922作为药敏试验的质控菌。

1.4 分离菌系统进化分群鉴定 CLERMONT 等［4］针对E. coli设计了一种新型种群分型方法，也称系统进化分群鉴定方法，即将不同种群E.coli的3个基因chuA、yjaA和TspE4.C2采用PCR方法扩增进行分群，根据 3 种基因扩增结果，可将E. coli分为 A（chuA和TspE4. C2均为阴性）、B1（chuA为阴性而TspE4. C2为阳性）、B2（chuA和yjaA均为阳性）和D（chuA为阳性而yjaA为阴性）群。参考该方法，以提取的E.coli分离株 DNA 为模板，PCR 法扩增chuA、yjaA和TspE4.C2基因，判定分离株的系统进化群。PCR 反应条件：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，共 35 个循环；72 ℃延伸10 min。引物序列见表1，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表1 E.coli系统进化分群引物Tab.1 Primers used for phylogenetic groups of E.coli

1.5 毒力基因及耐药基因检测 参考文献［1、5、8、11-14］设计并合成13 种毒力基因引物（见表2）和12 种耐药基因引物（见表3），引物由日本TaKaRa 公司合成。13 种毒力基因包括血清抗性蛋白（iss）、P菌毛黏附素（papC）、铁获得系统（iucD）、自主转运蛋白（tsh）、HPI 毒力岛（irp2、fyuA）、Lee 毒力岛（eaeA）、毒素（astA）、志贺毒素（stx1、stx2）、不耐热性肠毒素（LT1）、耐热性肠毒素（STb）、溶血素基因（hlyA）；12种耐药基因包括β-内酰胺类（blaTEM、blaSHV、blaCTX-M）、四环素类（tetA、tetB、tetD）、氨基糖苷类［aac（3）-Ⅳ、aadB］、喹诺酮类（qnrA、qnrB）和磺胺类（sul1、sul2）。以提取的82 株致病性E.coli的DNA 为模板，对上述13种毒力基因（反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性 50 s，53 ～ 62 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共 30 个循环；72 ℃延伸10 min）和12 种耐药基因（反应条件：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，54 ～ 65 ℃退火60 ～ 90 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min）进行PCR 扩增。扩增产物经胶回收试剂盒回收并送博迈德生物技术有限公司测序，测序结果采用NCBI-BLAST 比对，鉴定标准按照同源性≥97%判定。

表2 E.coli 13种毒力基因引物Tab.2 Primers used for 13 kinds of virulence genes of E.coli

表3 E.coli 12种耐药基因引物Tab.3 Primers used for 12 kinds of resistance genes of E.coli

2 结果

2.1 药敏试验结果 结果显示，82株致病性E.coli对13 种抗菌药物的耐药性普遍较高，其中对四环素（TE）的耐药菌株占比最高，为100%；对多西环素（DO）、阿莫西林（AMC）、氨苄西林（AM）、头孢喹肟（CEF）、复方磺胺甲恶唑（SXT）、卡那霉素（K）、阿米卡星（AMI）、链霉素（S）和多黏菌素B（PB）的耐药菌株占比为62. 20% ～97. 56%；而对氧氟沙星（OFL）、庆大霉素（GM）和环丙沙星（CIP）较为敏感，其敏感菌株占比分别为76.83%、69.51%和51.22%。见表4。多重耐药统计结果显示，全部菌株耐3 种及以上药物，多重耐药菌株占比为100%。其中，耐8、9、10和11种抗菌药物的菌株较多，占比分别为19.51%（16／82）、14. 63%（12／82）、17. 07%（14／82）和13.41%（11／82）；对8 种抗菌药物耐药的分离株最多，为19. 51%（16／82）。见图1。表明，该地区犊牛腹泻病例分离的82 株致病性E. coli多重耐药现象严重，临床用药建议进行药敏试验，选择敏感性药物进行治疗。

图1 82株致病性E.coli的多重耐药情况Fig. 1 Multiple drug resistance of 82 pathogenic E. coli isolates

表4 82株致病性E.coli药敏试验结果Tab.4 Drug sensitivity test results of 82 pathogenic E.coli isolates

2. 2 系统进化分群结果 利用E. coli分子分群的chuA、yiaA和TspE4. C2基因对 82 株致病性E. coli进行PCR扩增，结果显示，82株致病性E.coli中有40株（40／82，48. 78%）属于 A 群，为优势群系；26 株（26／82，31.71%）属于B1群，12株（12／82，14.63%）属于B2 群，剩余 4 株（4／82，4. 88%）属于 D 群。表明分离的82 株致病性E.coli以A+B1 群为主，而B2和D群分离率较低。

2.3 毒力基因检测结果 利用PCR 法对82 株致病性E.coli进行13种毒力基因扩增，结果显示，82株致病性E.coli携带11 种毒力基因，见图2，总检出率为84.6%（11／13）。其中，irp2检出率最高，为79.27%（65／82），其次为fyuA、eaeA和STb，检出率分别为63.41%（52／82）、53.66%（44／82）和50%（41／82）；iucD、astA、stx2、hlyA、papC、stx1和iss的检出率分别为47. 56%（39／82）、46. 34%（38／82）、40. 24%（33／82）、32. 93%（27／82）、26. 83%（22／82）、21. 95%（18／82）和15.85%（13／82）；82 株E.coli均未检测到毒力基因tsh和LT1。此外，含有7、6、5、4、3和2种毒力基因的菌株分别有6、11、9、16、28和8株；仅含1种毒力基因的菌株有4株。表明该地区致病性E.coli的毒力基因携带情况复杂，其中毒力基因irp2、fyuA、eaeA和STb的携带率较高。

图2 13种毒力基因的PCR检测结果Fig.2 PCR results of 13 virulence genes

2. 4 耐药基因检测结果 采用PCR 法对82 株致病性E. coli进行12 种耐药基因扩增，结果显示，氨基糖苷类耐药基因aadB和aac（3）-Ⅳ的检出率分别为75.6%（67／82）和2.4%（2／82）；四环素类耐药基因tetB的检出率最高，为91.5%（75／82），而tetD和tetA的检出率分别为70. 7%（58／82）和31. 7%（26／82）；喹诺酮耐药基因qnrA和qnrB的检出率分别为43.9%（36／82）和40.2%（33／82）；磺胺类耐药基因Sul1和Sul2的检出率较高，分别为86. 6%（71／82）和100%（82／82）；β-内酰胺类耐药基因blaTEM、blaSHV和blaCTX-M的检出率分别为100%（82／82）、69.5%（57／82）和39%（32／82）。见图3。表明，12种耐药基因广泛分布于该地区犊牛腹泻致病性E. coli中。

图3 82株致病性E.coli的耐药基因检出率Fig. 3 Detection rates of resistance genes in 82 pathogenic E.coli isolates

3 讨论

E.coli是临床上分离率较高的菌株［15］，可对多种动物造成感染而出现各种临床症状和病理变化，其发病率和死亡率较高，给养殖业带来严重经济损失。因此，了解并分析内蒙古通辽地区E. coli的系统分群、毒力基因携带情况以及耐药性和耐药基因分布具有重要意义。本研究对分离的82 株致病性E. coli进行了系统分群分析，发现分离株主要属于A 群（40／82，48. 78%），B1 群占31. 71%（26／82），而 B2 群和 D 群分离率较低。陈亚强等［16］报道，重庆地区禽源E. coli优势系统分群为A 群（48／93，51.61%）；许腾林等［17］报道，不同动物源ExPEC 中优势系统群为A 群（28／53，52. 8%）。本研究中优势系统群与以上报道一致。

E. coli的毒力因子种类繁多，这些毒力因子与E. coli的致病性存在一定的相关性，毒力基因的携带在一定程度上可以加强E.coli的致病性［18］。本研究结果显示，毒力基因irp2、fyuA、eaeA和STb的检出率较高，分别为79.27%（65／82）、63.41%（52／82）、53. 66%（44／82）和50%（41／82），其他毒力基因的检出率低于50%。本研究中irp2和fyuA的检出率低于贾青辉等［19］和高光平等［20］报道的该毒力基因的检出率；而eaeA和STb的检出率高于刘丽娟等［21］和张金宝等［22］报道的该毒力基因的检出率。表明E. coli毒力基因携带情况因其不同地区、不同动物来源而存在差异。根据毒力基因检测结果，认为内蒙古通辽地区牛场粪便存在潜在危害，需加强对粪便处理，以免产生威胁公共安全的问题。

研究表明，在人类和动物医学中长期和过度使用抗菌药物是导致细菌耐药性增加的重要因素［23］。本研究药敏试验结果显示，分离的82株致病性E.coli对13 种抗菌药物均有不同成程度的耐药，全部菌株对3种及以上药物呈现耐药，主要以8 ～11种耐药为主。分离株中对四环素类、β-内酰胺类和氨基糖苷类中的卡那霉素（K）、阿米卡星（AMI）、链霉素（S）和多黏菌素B（PB）的耐药菌株均占60%以上，表明抑菌效果不明显，临床用药建议不使用或谨慎使用。82株致病性E.coli对氧氟沙星（OFL）、庆大霉素（GM）和环丙沙星（CIP）较为敏感，敏感菌株占50%以上，但耐药性依然存在。因此，在大肠埃希菌性犊牛腹泻时可选择该3 种药物或联合用药。张星星等［24］报道，新疆犊牛源E. coli表现出严重的多重耐药现象，主要以3 ～7 种耐药为主，且对氨苄西林（AM）、链霉素（S）和四环素（TE）的耐药菌株占比较高，分别为71. 4%、66%和55. 3%。刘勃兴等［25］报道，河北省犊牛腹泻E. coli多重耐药现象严重，分离的菌株全部对2 种及以上药物耐药，且耐10 种及以上药物的菌株占34%。表明犊牛源E.coli多重耐药现象普遍存在，且各个国家及地区的检测结果存在差异，这可能是各个国家、地区对抗菌药物的使用情况和饲养管理模式不同导致的。此外，抗生素治疗是降低感染致病性E.coli导致的畜禽发病率和死亡率的主要治疗方法，谨慎使用抗菌药物对保持其在动物及人类治疗中的应用具有重要意义。

据研究，耐药基因是细菌先天具有的，也可通过质粒和转座子等获得并传播［26］。E.coli通常携带多种耐药质粒，在抗生素选择压力下，易将这些质粒转移给其他细菌，并使其产生耐药性或耐药谱变得更广，且耐药基因可通过与动物直接接触或通过畜产品生产链或农业中使用动物粪便肥料而间接传播给人类［27］。本研究中β-内酰胺类耐药基因blaTEM和磺胺类耐药基因Sul1和Sul2的检出率较高，分别为100%（82／82）、86.6%（71／82）和100%（82／82）。多数研究报道，以上 3 种耐药基因检出率均较高［8，28］。表明E.coli易对磺胺类和β-内酰胺类药物产生耐药性。此外，在不耐药菌株中也检测到了氨基糖苷类耐药基因，因此耐药性与耐药基因的相关性仍需进一步研究。耐药基因检测结果的差异可能与不同国家、不同地区E.coli的不同抗生素压力所致。

本研究检测并分析了内蒙古通辽地区犊牛腹泻致病性E.coli的药物敏感性、毒力基因和耐药基因的携带情况，结果显示，分离株对13种药物均具有不同程度的耐药，存在多重耐药现象，且毒力基因和耐药基因携带情况复杂，可能对公共卫生安全具有潜在危害。因此，应规范使用抗菌药物，并加强对粪便的处理。