花青素定性定量分析方法及其应用的研究进展

杜黎明，栾志慧，葛加荣，沙悦

花青素是通过苯丙烷途径产生的一种天然水溶性类黄酮色素，在花卉、蔬菜和水果中呈现出各种颜色.花青素颜色易受pH、光、植物激素、转录因子、温度和金属离子的影响.现有文献中报道了约700 种花青素化合物，它们具有潜在的健康益处，也是天然着色剂的来源［1］.富含花青素的植物包括葡萄、蓝莓、萝卜、草莓、桃子、梨和李子等.许多体外和体内研究表明，花青素是具有多种健康益处的潜在抗氧化剂，如抗癌、抗糖尿病、抗高血压和抗肥胖［2］.这些化合物还与预防心血管疾病，改善视觉和神经健康益处有关.此外，还证明花青素可以增加与组织再生密切相关的成纤维细胞增殖的代谢活性［3］.由于花青素抗氧化活性、颜色和其他物理性质，其在化妆品行业、食品着色行业中的应用也更加广泛.富含花青素的花朵与果实也越来越多地被用于农业食品行业，作为多种美食菜肴的佐餐或作为饮食的一部分.

已有研究成果尽管已经广泛证实了花青素的益处和特性，但很少涉及使用创新的提取和分析技术来研究植物中的花青素，提取后花青素的稳定性和保持与基质结合的强烈趋势仍然是需要解决的主要问题.目前，有大量文章关于对花青素提取、纯化、分离与鉴定方法的优化.本文旨在讨论各种方法在花青素定性定量分析中的应用，并强调这些技术对花青素分析的重要性，为今后花青素创新提取方法和分析技术奠定基础.

1 花青素的生物合成

花青素的生物合成途径在拟南芥、烟草等模式植物或各种作物中都有很好的表征，并且大致是高度保守的.这种途径是苯丙素途径的一个重要分支，从苯丙氨酸开始（图1）并最终生成不同种类花青素.苯丙氨酸被苯丙氨酸解氨酶（PAL）转化为肉桂酸.肉桂酸在肉桂酸−4−羟化酶（C4H）的作用下转化为p−香豆酸，随后通过4−香豆CoA 连接酶（4CL）转化为4−香豆酰CoA.在查尔酮合成酶（CHS）的作用下，将一个4−香豆酰CoA（I）分子与三个丙二酰CoA（II）分子缩合，生成四羟基查尔酮（III）.四羟基查尔酮通过查尔酮异构酶（CHI）的作用异构化产生三羟黄烷酮（IV），也称柚皮素.柚皮素通过黄烷酮−3−羟化酶（F3H）在C 环上羟基化，通过黄烷醇−3'羟化酶（F3'H）或黄烷酮−3'5'羟化酶（F3'5'H）在B 环上羟基化成各种黄酮类化合物的中心支点，生成二氢山奈酚（VII）、二氢槲皮素（VIII）和二氢杨梅素（IX）.F3'H 和F3'5'H 对柚皮素的B 环羟基化分别产生依诺二烯醇（V）和五羟基黄烷酮（VI）.花青素生物合成的下一步是二氢黄酮醇4−还原酶（DFR）作用于三种双氢黄酮醇中的一种，即二氢山奈酚（VII）、二氢槲皮素（VIII）或二氢杨梅素（IX），以产生相应的无色花青素，即无色矢车菊素（X）、无色天竺葵素（XI）和无色飞燕草素（XII）.再通过白花青苷加氧酶/花青素合酶（LDOX/ANS）的作用转化为相应的花青素（红色天竺葵素（XIII）、紫色矢车菊素（XIV）和蓝色飞燕草素（XV））.花青素生物合成的最后一步是O−糖基化（图2）.与保守的主要类黄酮途径相反，通过糖基化对花青素的修饰是多样的，具有家族和物种依赖性.驱动这些修饰的酶特定于修饰的位置和供体底物.细胞质中的糖基转移酶促进糖基化.在ANS 稳定花青素作用后，糖基化立即发生.最常研究的糖基化为UDP−3−O−葡萄糖基转移酶（UFGT/3GT）添加葡萄糖基［4］.

图1 花青素合成途径

图2 花青素糖基化过程

花青素的合成受调控基因控制.在转录水平上，花青素生物合成基因的表达受R2R3−MYB 转录因子以及由R2R4−MYB、bHLH 和WD40 因子形成的三元复合物（称为MBW 复合物）［5］的调 节.MYB75 是属于R2R3−MYB 家族的转录因子，在多种植物中被证实有调控花青素合成的作用.例如，过度表达MYB75 基因的拟南芥植物在根、茎、叶和花中显示出更多的花青素积累，而相反，MYB75 突变体显示出这些分子的较低积累［6］.MYB75 在调节花青素积累方面的重要性似乎也在一些作物中得到证实，如猕猴桃［6］、番茄［7］、丹参［8］、芜菁［9］等.目前研究得出WD40 重复基因OsTTG1 调控水稻花青素生物合成［10］，对其研究大多存在于生菜、甘蓝、小麦、油菜等作物中.

不同的基因在不同的组织中以不同的水平表达，作为发育阶段和环境条件的函数.特定组织中的基因组通过影响受体的目标基因凸显其特异性，从而影响特定花青素生物合成基因的表达，从而调节该组织中类黄酮的差异积累.因此，花青素在植物组织中的正确分布需要类黄酮生物合成途径的准确时空调控，并反映转录因子的组织特异性组合.

2 花青素的定性定量分析

2.1 花青素的提取

从自然界分离的花青素高度不稳定且易于降解，这导致生物活性丧失和褪色.影响降解速率的因素包括光照、温度、pH、氧气、酶、和湿度等.基于花青素复杂性和对具有特定化学特征的特定分子的选择性搜索，从生物基质中提取花青素有不同的策略［11］.例如，花青素的提取通常通过使用水性/有机混合物进行，其中有机部分的贡献很大.相反，花青素通常用更亲水的溶剂或更显著的水基混合物提取.在所有情况下，保持黄烷形式的化合物的电离状态是非常有用的，可以通过向水相中添加无机或有机酸来实现这一目标.植物、食品和农业样品通常用乙醇/甲醇∶水混合物（70−95∶30−5）萃取，用盐酸、甲酸或其他有机酸（如柠檬酸）酸化［12］.当基质耐酸性均质化时，例如在植物种子的情况下，选择在超声波和温度的帮助下使用最强和更亲脂性的有机溶剂［13］.相反，液体基质（即红酒、果渣和果汁）用酸性酒精溶液处理［14−16］.

提取温度和pH 也影响花青素的回收.在水提取之前加热植物材料，不仅使多酚氧化酶的水解活性失活，而且有助于破坏植物细胞，提高花青素提取的产量，不同的植物材料根据体系的可萃取性，以及基质中总花青素的数量，萃取过程会重复几轮，每部分最适温度及pH 等均不同.NICOUÉ 等人比较了温度、溶剂和萃取溶剂的pH 对野生蓝莓花青素回收的影响.在乙醇和磷酸（pH 值4.6；0.02%v/v）中提取的总花色苷和单体花色苷的产率最高［17］.国内研究也在寻找各个物种花青素提取的最适温度，发现酸法提取紫茄皮花青素的最优提取方案提取温度为60 ℃［18］、洛神花花青素最佳提取工艺条件温度为30 ℃［19］、蓝莓酒渣花青素提取的最佳提取温度为50 ℃［20］.

然而，使用这些溶剂会产生一系列剧毒废物，需要在处置前进行处理［21］.因此，人们越来越担心传统溶剂的环境影响和有害健康影响，这增加了提取过程和成品过程中工人安全的法律要求［22］.在过去的几十年中，人们不断开发新的生态提取替代品.最近，一种被称为天然深共晶溶剂（NADES）的新型绿色提取技术已经出现，以满足生物降解性、可持续性、低毒性、低成本和易于处理的要求.使用天然深共晶溶剂（NADES）提取花青素是一种相对新颖、生物相容和绿色的方法，处于可持续发展的前沿，因此近年来激发了科学界的兴趣［23］.对几种基于NADES 的花青素提取方法进行了优化，其效果与传统有机溶剂相同，但与使用有机溶剂的提取相比，产率更好.NADES 代表了一种极好的、有用的更新策略，用于药物和营养品应用的基于花青素的产品的绿色提取和生物相容性制备［24］.目前对其应用于丹参活性成分的绿色提取及催化转化［25］、提取短瓣金莲花黄酮类成分［26］、甜叶菊中甜菊糖绿色提取［27］等，具有很高的现实应用前景.

2.2 花青素的纯化

有效的纯化方法确保了化合物的更好表征，从而确保了更可靠的光谱信息.提取的材料含有几种化合物，如糖、有机酸、氨基酸和蛋白质等，这些化合物可能会损害花青素的稳定性.提取后，根据基质（水果、叶子或液体生物样品），纯化程序的第一步是区分富含绿色和红色色素的提取物.首先必须去除的强叶绿素成分，其次纯化富含花青素的基质（水果、花朵或液体生物样品）.叶绿素消除后，通常根据目的通过不同的色谱步骤进行纯化，包括不同的固定相.对于水性提取物，最早期方法是在固相萃取（SPE）树脂（如C18 滤筒）和Sephadex 基质上吸收花青素，以消除更多极性非保留副产物［28］.在更广泛的吸附纯化技术的进展中，还研究了硅胶、Amberlite IRC 80、237 Amberlitte XAD−7HP 和DOWEX 50WX8等对花青素有更高吸附和解吸能力［29］.在某些情况下，高速逆流色谱法（HSCCC）用于从食品中分离花青素的某些成分.HSCCC 的开发因其低压、高流速、广泛的溶剂和更便宜的固定相而广为人知.其允许在XAD−7 树脂柱富集粗提取物后分离纯化合物.观察到由正丁醇/乙酸乙酯/0.5%乙酸（3∶1∶4）和0.2%三氟乙酸/正丁醇−叔丁基甲醚/乙腈（6∶5∶1）组成的HSCCC 两相体系是色谱分离的良好混合物，经HPLC 和NMR 分析证实［30］.值得一提的是，尽管用不同的溶剂提取方法多种多样，但这些方法只能用于实验或表征目的.作为人类食用成分或一般天然色素的提取应严格用水进行，否则必须仔细评估溶剂残留物.

2.3 花青素的分离与鉴定

反相LC（RP−LC）是分离最常用的方法.不同的实验室通常采用不同的参数条件来优化花青素的分离，因此很难确定单一的标准程序［31］.另一种检测技术为UV−Vis，其使用UV 和可见光束通过流动池.它包含一个传感器，可以在分析物通过柱时检测光吸收率的变化［32］.UV 不仅提供了糖基化的信息，还提供了糖分子中酰化的程度.UV−Vis 光谱可获得大量信息，尤其是酰化花青素，在UV−Vis光谱中提供典型指纹.UV−Vis 光谱法本身可能不够有效地识别花青素分子.由于两个或更多的花青素分子可以产生类似的光谱，仅基于UV−Vis 可能会出现错误检测［33］.目前，花青素色谱分析主要基于高效和超高效液相色谱（HPLC 和UHPLC）方法，结合紫外可见分光光度法和/或质谱检测.HPLC 的正常条件为C18 柱；检测波长520 mm；乙腈：由磷酸、甲酸或三氟乙酸调节pH 值的水溶剂系统［34］.HPLC技术的敏感性及其简单性使得这种分析方法在花青素和花青素的定性和定量研究中很受欢迎.常见的5 µm 粒径HPLC 柱在大多数分析实验室中仍然广泛使用，对花青素和花青素的复杂混合物仍具有良好的选择性和分辨率.与HPLC 相比，UHPLC 有更短的分离时间，因此流动相消耗更低［35］.

来自不同串联或平行色谱分离（硅胶、阳离子交换和/或反相）的纯化合物可以通过核磁共振（NMR）、高分辨率和串联质谱（HR−MS/MSn）和红外光谱（FT−IR）进行结构表征.MS/MSn 分析有助于识别特定的断裂途径［33］.例如，花青素可以通过质谱诱导的MS/MS 裂解后糖部分的损失与它们的苷元（花青素）区分.相反，苷元对交叉环裂解敏感，尤其是在环C上，产生不同的氧鎓片段［34］.在其他花青素研究中，特别是在测定复杂样品中的异构体时，离子迁移质谱（IM−MS）已被证明是一种具有高通量和灵敏度的新型分析方法.IM−MS根据大小、形状和电荷分离气态离子来工作.通常，LC−MS 用于进一步分析并鉴定通过IM−MS 分离的化合物级分.多年来，MS/MS 数据库大大有助于鉴定植物化合物或检测到的代谢物，特别是当使用NMR 342 和X 射线晶体学无法进行完整结构测定时［35］.因此，串联质谱法（MS/MSn）结合HPLC 或UHPLC 是一个强大的工具.MS/MSn 可以分析不同的分子转变和碎裂，并将其与文献中的数据和最新的质谱数据库进行比较.目前，LC−MS 已被证明是鉴定类黄酮苷，特别是花青素的有力分析工具，广泛应用于日常研究中.

以上各项研究中获得的结果与方法，代表了对许多与健康促进特性或其他用途相关的有吸引力基质的提取技术的实质性改进与优化.研究人员就植物材料中花青素的最佳提取条件达成了广泛一致，这将有助于提取物的化学成分的一致性，并将其用作潜在的营养物质与色素用于体内和临床研究.从这项研究中获得的结果是在广泛领域进行进一步研究的起点.利用各种技术在实验室或工业水平上提取和分析花青素，以形成富集的复合物或获得可用于食品、医药或化妆品行业的提取物.此外，这些结果导致对花青素的生物活性与其生物利用度之间的可能关系进行了更深入的研究，以及根据环境条件或这些植物所受的外部影响研究不同物种中的花青素含量或花青素的表达.

3 花青素的营养和应用

3.1 花青素对人体的保健作用

花青素可食用并能进行吸收代谢.在口腔中，花青素主要由口腔微生物群代谢，这些微生物群可以去除糖苷基团并将花青素转化为相应的查尔酮.在胃中，花青素被迅速吸收，但最大吸收部位是肠道.花青素在肠道中被吸收，并通过门静脉到达肝脏.在这里，它们在肠肝循环中被代谢、分泌和再吸收，以重新启动整个途径［36］.未被吸收的花青素到达结肠，在那里它们被结肠微生物群广泛修饰，这可能会释放苷元并产生简单的酚类物质［37］，然后可被结肠粘膜吸收.然而，花青素可能反过来调节结肠微生物群组成.花青素的摄入会导致双歧杆菌、乳杆菌或放线杆菌等有益细菌的增加［38］.众所周知，益生菌可能对人体健康产生多种有益影响，因此，摄入花青素后观察到的积极影响可能部分是由于肠道微生物群的调节.

花青素具有抗氧化功效.花青素的抗氧化功效由其结构控制.研究表明茄子和萝卜中提取的花青素对氧自由基吸收能力的三维定量结构−活性关系（3D−QSAR）［39］.羟基对花青素B 环、甲氧基化和3 位糖基单元数量的影响有关.B 环中的羟基被甲氧基取代降低了抗氧化能力［40］.花青素抗炎、抗癌、抗高血压和抗肿瘤活性的研究可能是花青素研究的下一个很好的探索领域.目前研究人员重点关注心血管和神经退行性疾病［37］和Ⅱ型糖尿病［39］的影响并对其开展研究.此外，花青素可以增加与组织再生密切相关的成纤维细胞增殖的代谢活性，这就是花青素被用于治疗不同疾病的原因.

3.2 花青素对食品的着色作用

食品工业使用许多化学物质作为食品着色剂.然而，这种使用带来了许多问题，主要是健康风险，人工合成染料被怀疑会造成不良的行为影响.花青素具有安全性和潜在的健康保护作用，是合成物质的一种有吸引力的替代品.在欧洲、日本、美国和其他国家广泛允许将花青素用作食品和饮料中的食品着色剂［40］.可以从花青素添加中受益的产品包括软饮料、面包、果酱、果冻、糖果或乳制品等.除了为食物提供颜色，花青素还可以提供额外的抗氧化保护作用.同时也可以为食物提供独特的品质，因为它们可以增加营养潜力，对消费者产生健康促进作用.然而，使用花青素作为天然食品着色剂存在几个问题.首先，花青素的稳定性不是最佳的，因为它们往往会快速降解，主要原因是光、氧、酶、金属、其他氧化剂的存在、pH 和温度［41］.其次，与合成着色剂相比，花青素价格相当昂贵.作为潜在食品着色剂的花青素来源有葡萄皮、蓝莓、萝卜、红薯、红甘蓝、桑葚、黑胡萝卜、红豆、西梅、木槿等［42］.一般来说，酰化花青素是首选的食品着色剂，因为它们比非酰化花青素更稳定.一些水果、蔬菜或乔木可以低成本提取大量的非酰化花青素，因此，非酰化花青素在食品工业中也有潜在的用途［43］.花青素作为食品着色剂由于自然、有机和可持续食品市场的动态增长，对非合成食品着色剂的需求继续增加，花青素在过去三十年中填补了这一空白［44］.

4 结论

花青素及其家族中无数成员产生的途径是天然氧化剂及色素生物遗传学中最常见的研究领域之一.这一焦点（检测分子、其稳定性以及在各种提取与鉴定）是由与这些分子相关的需求驱动的.花青素具有抗氧化、抗炎和抗癌活性.他们缓解癌症、糖尿病和其他代谢紊乱引起的并发症的能力已经在研究及临床得到验证.然而，对其定性定量分析及应用应开展更多的研究，以保证其质量及对人体的作用效益.目前花青素含量更高的产品从研究中推向市场，分析和稳定性相关的问题是该行业目前面临的两个问题.自然界中分离的花青素极不稳定，易降解，导致生物活性丧失和变色.因此，如何在保证其稳定的同时加以分析是目前的研究重难点，对于不同植物不同组织的提取分析方法也有所不同，应该总结并优化前文所示方式方法，构建成熟的系统利用现有技术进行分析，使天然花青素更多进入日常的生产生活，产生更多的经济利益和营养健康价值.

花青素在改善各种疾病方面的作用一直是人与自然相互作用的组成部分.然而，对花青素导致这些效应的机制和作用方式的更深入理解尚未阐明.目前的研究仅限于分子水平，但随着科学技术的进步，研究者可以加强综合基因组学、表型基因组学、蛋白质组学和代谢组学研究，并使用多种手段探索植物中花青素调控机制和代谢途径的未知部分，然后揭示花青素与颜色、含量及稳定性的关系.总的来说，随着研究的深入，将对花青素定性定量分析的方法及机制有更清晰的了解，从而建立一个稳定的系统，利用生物学技术提取及鉴定花青素，这将为未来的花青素生信分析提供坚实的技术和信息基础.