液态三丁酸甘油酯对小鼠生长、脏器指数及十二指肠形态结构的影响

吴 凯 管先超 曲嘉晨 苗人方 孙媛之 蒲佳泽 曲永利

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院，农业农村部东北平原农业绿色低碳重点实验室，大庆163000)

三丁酸甘油酯(tributyrin，TB)是由1分子甘油酯和3分子丁酸酯化而成的一种短链脂肪酸酯[1]。三丁酸甘油酯只有在胰脂肪酶的作用下方可缓慢释放丁酸和甘油，所以三丁酸甘油酯在胃中不分解，而是经口服用后到达肠道经胰脂肪酶分解释放，可达到修复肠绒毛、抑制病原菌等利于机体的作用。丁酸是通过直接影响小肠的生长和分化通过胃肠微生物发酵作用于肠细胞的代谢产物之一。此外，丁酸具有各种生理作用，包括增强肠屏障功能和黏膜免疫等[2]。由于其对肠道的修护作用，在医学上广泛地运用于预防和治疗结肠癌、肠道菌群紊乱、急慢性腹泻、溃疡性结肠炎等疾病[3]。

三丁酸甘油酯作为饲料添加剂成为人们日益关注的热点[4]。三丁酸甘油酯作为饲料添加剂使用时，其对于机体的功效甚多，如改善动物的生长性能、提高机体免疫力、促进肠道发育、调节肠道微生物和抗炎等利于机体的生物效用[5]。Liu等[6]研究表明，在断奶荷斯坦奶牛饲粮中添加三丁酸甘油酯可显著性缓解犊牛机体由于断奶引起的氧化应激和炎症状态。Guo等[7]在饲粮中添加三丁酸甘油酯后，通过测定牛舍在早上、中午和晚上的温湿度指数来确定奶牛是否处于热应激环境，并通过实时定量PCR和免疫印迹分析测定炎性因子的表达以及血液生化指标，结果显示，三丁酸甘油酯能显著降低血清中天冬氨酸转氨酶活性与总胆红素、肌酐、白蛋白和球蛋白的含量，并减轻奶牛热应激引起的肝肾损伤；此外，三丁酸甘油酯还可以显著减少中间细胞的数量，提高血红蛋白含量。以上结果表明，三丁酸甘油酯可通过减轻淋巴细胞的炎症反应，减轻热应激，提高奶牛的生产性能。Papadopoulos等[8]研究表明，饲粮中添加三丁酸甘油酯可改善仔猪小肠的形态结构并增强免疫细胞的反应，表明三丁酸甘油酯可改善小肠健康和提高机体免疫力。何进田等[9]研究表明，三丁酸甘油酯对宫内发育迟缓哺乳仔猪的肝脏发育和免疫功能完善有显著疗效，使肝脏中胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-4(IL-4)含量与正常仔猪一致。除在奶牛和仔猪上的应用外，三丁酸甘油酯还有在肉鸡上应用的报道，研究表明，三丁酸甘油酯能促进肉鸡的肠道健康，提高其免疫介导，从而改善肉鸡的氧化应激反应。Gong等[10]通过评估三丁酸甘油酯对黄羽肉鸡生长性能、血液生化指标和肠道微生物群的影响，明确了三丁酸甘油酯可通过调节肉仔鸡的血液生化指标和盲肠微生物区系组成来改善生长性能。

近年来，虽有研究表明饲粮中添加三丁酸甘油酯可改善动物肠道健康，并提高动物的生产性能，但在前人的研究中三丁酸甘油酯采用的均是采用固体粉末状形式与饲粮混伴后进行补充，且三丁酸甘油酯均按照与饲粮质量的百分比给予动物，往往忽略了动物机体自重及对三丁酸甘油酯的吸收。按照以往的研究结果，饲粮中三丁酸甘油酯的添加量为0.1%～0.5%。因此，本试验在饲喂常规饲粮的基础上按照体重进行液态三丁酸甘油酯补饲，评估4周龄小鼠补饲4周不同剂量液态三丁酸甘油酯后对其脏器指数、十二指肠形态结构以及生长发育的影响，明确液态三丁酸甘油酯的适宜补饲量，为液态三丁酸甘油酯在动物生产中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用液态三丁酸甘油酯购于山东省潍坊市某生物科技有限公司，其三丁酸甘油酯含量≥95%。

1.2 试验设计

选用4周龄、初始体重为(20±1) g的无特定病原体(SPF)级昆明(KM)雌性小鼠125只，预饲3 d后随机分为5组，每组25只，4组小鼠之间体重无显著差异(P<0.05)。4组小鼠每天每只饲喂6 g小鼠商品饲粮(营养水平：粗蛋白质含量≥18%、粗脂肪含量≥4%、粗纤维含量≤5%、粗灰分含量≤8%、水分含量≤10%、钙含量在1.0%～1.8%，磷含量在0.6%～1.2%)，在此基础上，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组小鼠每日分别灌服1.0、2.5、3.5、5.0 g/kg BW液态三丁酸甘油酯，空白组小鼠每日每只灌服0.2 mL生理盐水。每天早晨称量小鼠体重并记录，试验期为28 d。

1.3 样品采集

在试验第1、7、14、21、28天每组随机抓取5只小鼠采样。断颈处死小鼠，剖开腹腔，取胸腺、心脏、肝脏、脾脏和肾脏称重并做好记录，采集2 cm左右十二指肠组织样品，灭菌生理盐水冲洗干净，置于4%甲醛缓冲溶液中固定，以备制作切片。

1.4 测定指标

1.4.1 平均日增重

以组为单位，每天晨饲前对小鼠进行称重，做好记录，计算试验第1～7天、第8～14天、第15～21天、第22～28天的平均日增重。

1.4.2 脏器指数

每只小鼠称重,完整取下心脏、肝脏、脾脏、胸腺和肾脏，灭菌生理盐水冲洗干净，分别称重并记录，计算相应的脏器指数。

脏器指数(%)=[脏器重量(g)/体重(g)]×100。

1.4.3 十二指肠形态结构观察

将4%甲醛缓冲溶液中固定的小鼠十二指肠组织样品取出，进行脱水、石蜡包埋、切片，切片厚度3～5 μm，采用苏木精-伊红(HE)染色，使用正倒置一体荧光显微镜对切片进行观察与拍照，测定绒毛高度、隐窝深度，计算绒隐比(绒毛高度与隐窝深度)。

1.5 统计分析

试验所得数据用Excel 2021进行初步整理，所有数据均以平均值±标准差(mean±SD)表示，再用SPSS 23.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Duncan氏法进行多重比较。P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结 果

2.1 液态三丁酸甘油酯对小鼠平均日增重的影响

如表1所示，在第1～7天，试验Ⅲ、Ⅳ组的平均日增重显著高于空白组(P<0.05)；在第8～14天，试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的平均日增重显著高于空白组(P<0.05)；在第15～21天，试验Ⅱ组的平均日增重显著高于试验Ⅳ组(P<0.05)；在第22～28天，试验Ⅱ组的平均日增重显著高于空白组和试验Ⅳ组(P<0.05)。试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间各阶段的平均日增重均没有显著差异(P>0.05)。

表1 液态三丁酸甘油酯对小鼠平均日增重的影响

2.2 液态三丁酸甘油酯对小鼠脏器指数的影响

如表2所示，在整个试验期内各组之间小鼠各脏器指数均差异不显著(P>0.05)。

表2 液态三丁酸甘油酯对小鼠脏器指数的影响

续表2项目 Items空白组Blank group试验Ⅰ组 Test group Ⅰ试验Ⅱ组 Test group Ⅱ试验Ⅲ组 Test group Ⅲ试验Ⅳ组 Test group ⅣP值P-value第28天 Day 28心脏 Heart0.49±0.050.50±0.050.55±0.050.53±0.040.57±0.070.133肝脏 Liver4.47±0.364.26±0.464.08±0.313.94±0.354.33±0.270.192脾脏 Spleen0.29±0.080.26±0.060.24±0.050.24±0.040.25±0.060.694肾脏 Kidney1.11±0.071.20±0.161.24±0.141.08±0.131.05±0.060.093胸腺 Thymus0.39±0.090.41±0.030.39±0.090.39±0.040.38±0.020.958

2.3 液态三丁酸甘油酯对小鼠十二指肠形态结构的影响

小鼠十二指肠组织切片见图1。如表3所示，试验进行到第14天时，试验Ⅲ组十二指肠绒毛高度显著大于空白组和试验Ⅰ、Ⅱ组(P<0.05)；试验进行到第28天时，空白组十二指肠隐窝深度显著大于试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组(P<0.05)；在整个试验期间各组之间十二指肠绒毛宽度差异不显著(P>0.05)；试验进行到第28天时，各试验组的十二指肠绒隐比均显著大于空白组(P<0.05)，同时试验Ⅲ组还显著大于试验Ⅰ组(P<0.05)。

A:空白组第1天；B：试验Ⅰ组第1天；C:试验Ⅱ组第1天；D:试验Ⅲ组第1天；E:试验Ⅳ组第1天；F:空白组第14天；G:试验Ⅰ组第14天；H:试验Ⅱ组第14天；I:试验Ⅲ组第14天；J:试验Ⅳ组第14天；K:空白组第28天；L:试验Ⅰ组第28天；M:试验Ⅱ组第28天；N:试验Ⅲ组第28天；O:试验Ⅳ组第28天.

表3 液态三丁酸甘油酯对小鼠十二指肠形态结构的影响

续表3项目Items空白组Blank group试验Ⅰ组 Test group Ⅰ试验Ⅱ组 Test group Ⅱ试验Ⅲ组 Test group Ⅲ试验Ⅳ组 Test group ⅣP值P-value绒毛宽度 Villus width/μm第1天 Day 1105.33±13.66112.72±25.43110.42±10.2799.13±15.77105.74±18.360.842第14天 Day 14118.69±8.42105.16±19.11129.69±24.13121.54±15.28121.85±30.570.629第28天 Day 28112.76±12.63120.30±40.64123.94±26.11101.54±22.98119.17±11.450.647绒隐比 V/C第1天 Day 11.78±0.252.26±0.232.34±0.832.78±1.322.24±0.100.583第14天 Day 142.89±1.022.91±0.632.81±0.284.05±0.173.65±0.650.124第28天 Day 283.44±0.68c4.18±0.34b5.10±1.32ab5.74±0.43a4.79±0.00ab0.022

3 讨 论

3.1 液态三丁酸甘油酯对小鼠平均日增重的影响

三丁酸甘油酯可在胰蛋白的作用下，分解成丁酸和甘油，修复小肠绒毛，提高肠道免疫力，抵抗病原菌入侵，从而提高动物的生长性能[11]。三丁酸甘油酯促进动物生长的原因包括以下2个方面：一方面，三丁酸甘油酯对动物的生理作用主要是丁酸的功能，丁酸容易被肠腔吸收，可以快速为肠道提供能量；另一方面，三丁酸甘油酯不同于一般的丁酸盐会被胃和前肠吸收，三丁酸甘油酯在胃中不分解，可作用于消化道后段[12]。Wang等[13]研究表明，在肉鸡饲粮中添加三丁酸甘油酯可提高每日增重量。Liu等[6]在犊牛的乳液中添加三丁酸甘油酯后评估犊牛的生长性能等指标，结果表明三丁酸甘油酯可增加犊牛的日增重。Miragoli等[14]为明确三丁酸甘油酯是否可替代抗生素用于改善猪的生长性能，通过在断奶仔猪饲粮中添加0.2%的三丁酸甘油酯评估仔猪的日增重以及肠道微生物群，结果表明，饲粮中添加三丁酸甘油酯组的仔猪日增重显著高于对照组，且肠道微生物群的能量利用率更高，由此表明三丁酸甘油酯有助于改善断奶仔猪的生长性能。在本试验中，试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的平均日增重均高于空白组，结果表明补饲1.0～3.5 g/kg BW液态三丁酸甘油酯可促进小鼠体重的增加，这一结果与前人在肉鸡[13]、犊牛[6]和断奶仔猪[14]上的研究结果一致，但试验Ⅳ组的平均日增重反而降低，这可能是因为液态三丁酸甘油酯在大量服用后，由于其具有异味等原因，会引起动物的厌食等行为，从而引起增重减少[15]。

3.2 液态三丁酸甘油酯对小鼠脏器指数的影响

动物的脏器质量是重要的生物学特性指标，可以在一定程度上明确动物机体内各器官发育的程度。在一般情况下，脏器重量与机体重量呈正比关系，但脏器质量受到多种因素的影响，如自身因素的影响(品种、性别、体重和年龄等)和试验因素(季节和饲养条件等)的影响[16]。动物机体受损后，其体内脏器重量会改变，脏器指数也会因此发生改变，脏器指数变大，可能表明该脏器发生充血、水肿、增生、肥大等病变；脏器指数变小，可能表明该脏器已经萎缩或发生其他损伤现象[17]。Piva等[18]将固体三丁酸甘油酯添加于饲粮中饲喂保育猪42 d后测定体重、器官质量等指标，结果表明补饲三丁酸甘油酯猪与未补饲的猪之间器官质量无显著差异。在本研究中，脏器指数统计结果表明液态三丁酸甘油酯对小鼠的脏器指数无显著影响，这也与金慧琴等[19]的研究结果一致，脏器指数无显著变化，表明随着小鼠机体增重，脏器质量也随之增加，因此各组之间无显著差异，也进一步表明三丁酸甘油酯主要作用于小肠，提升肠道健康。但是目前关于三丁酸甘油酯服用后对生长期动物脏器指数影响的研究报道不多，其对脏器指数的影响还需进一步研究。

3.3 液态三丁酸甘油酯对小鼠十二指肠形态结构的影响

三丁酸甘油酯除了促进动物的体重增加外，还可调节动物肠道微生物群和免疫能力等[8]。Mocanu等[20]在回盲部切除小鼠的饲粮中添加三丁酸甘油酯，结果显示三丁酸甘油酯可显著降低由于回盲部切除引发的胃肠道炎症以及促进肠道微生物的繁殖。小肠是动物体内最重要的消化和吸收部位，其绒毛高度和隐窝深度反映了小肠形态结构的完整性。绒毛高度和隐窝深度是衡量动物肠道健康的重要指标，绒隐比可以综合反映小肠的功能状况，该比值提高，意味着黏膜的消化吸收功能改[21]。三丁酸甘油酯可增加动物肠道绒毛高度，降低隐窝深度，利于维持肠道黏膜形态，改善肠道吸收功能。Piva等[18]的研究中，固体三丁酸甘油酯可显著降低断奶仔猪肠道隐窝深度，显著提高肠道绒毛高度，对绒毛宽度无显著影响。Zhang等[22]和Chen等[23]将三丁酸甘油酯作为膳食补充剂饲喂断奶仔猪后，前者研究表明可三丁酸甘油酯显著增加十二指肠绒毛高度，后者研究表明三丁酸甘油酯可显著增加十二指肠绒隐比。本研究中，小鼠补饲3.5 g/kg BW液态三丁酸甘油酯后可显著提高十二指肠绒毛高度和绒隐比，降低十二指肠隐窝深度，与上述研究结果一致，说明给小鼠补饲3.5 g/kg BW液态三丁酸甘油酯可改善小鼠十二指肠形态结构。

4 结 论

综上可知，在饲喂常规饲粮的基础上补饲1.0～3.5 g/kg BW液态三丁酸甘油酯可促进小鼠生长，补饲3.5 g/kg BW液态三丁酸甘油酯剂量还可提高小鼠十二指肠绒毛高度、绒隐比，降低隐窝深度，改善十二指肠形态结构。