HPLC测定壮药羊开口中3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量

刘立辉，黄丽玲，唐林波，常 华，邹 洵

桂林三金药业股份有限公司，广西 桂林 541004

羊开口Radix Melastomatis normalis，壮药名为棵芒难，为野牡丹科（Melastomaceae）野牡丹属MelastomaL.植物展毛野牡丹Melastoma normaleD.Don 的干燥根，为广西壮族地区习用药材，收载于《广西壮族自治区壮药质量标准（第一卷）》，味甘、酸、涩，微温，具有收敛、止血、解毒的功效，用于泄痢、崩漏带下、内外伤出血[1]。羊开口是中成药三金片系列产品的重要原料之一，但现有质量标准并没有关于羊开口的含量测定项，仅有少量文献报道测定羊开口中没食子酸和鞣花酸的含量研究[2-3]。

本课题组前期对羊开口进行了化学成分研究，发现3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷为羊开口的特征性成分之一[4]。此外，文献报道此类成分具有良好的抗肿瘤、抗氧化、抗菌和抗病毒等药理活性，且该类成分的化学性质相对比较稳定[5-6]。因此，选择3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷作为羊开口的含量测定指标成分。鉴于现有羊开口的质量标准较简单，缺少含量测定项，本实验对羊开口的特征性成分之一的3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷进行HPLC 含量测定研究，以期为羊开口质量标准的完善提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 高效液相色谱仪（美国Waters 公司）；2996 PDA 检测器（美国Waters 公司）；Empower 2 色谱工作站；BRANSON BUG 40-60 超声波清洗仪（上海必能信公司，功率250 W，频率40 kHz）；XP 205 型电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司，d=0.01 mg）；GF-200 型电子天平（日本AND公司，d=0.001 g）；MILLI-Q 型密理博超纯水仪（德国Merck 公司）；DZF-6500 型真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）。

1.2 试药

3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品为本课题组自制，通过解析其MS、1H-NMR、13C-NMR 数据，并参照文献报道[7]确定结构，HPLC峰面积归一化法计算其质量分数大于99.0%。乙腈、甲醇为色谱纯（德国Merck 公司），高效液相用水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

15 批羊开口药材分别采自广西各地，经中国科学院广西植物研究所蒋水元研究员鉴定均为野牡丹科植物展毛野牡丹M.normaleD.Don 的干燥根，具体产地见表1。

表1 羊开口产地信息Table 1 Origin information of Radix Melastomatis normalis

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

取干燥至恒定质量的3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加二甲基亚砜溶解制成含0.02 mg/mL 3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备

取本品粉末（过80 目筛）约2.0 g，精密称定，置100 mL 具塞锥形瓶中，精密加入80%丙酮25 mL，称定质量，密塞，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）60 min，放冷至室温，再称定质量，用80%丙酮补足减失的质量，摇匀，静置，吸取上清液，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3 色谱条件

Welch Materials Ultimate AQ C18反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相A 相为乙腈，B相为0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0～50 min，90%～70% B；50～51 min，70%～90% B。体积流量为1.0 mL/min，检测波长为246 nm，柱温为35 ℃，进样量为10 μL。在此条件下，理论塔板数按3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰计算不得低于80 000，3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷色谱峰与相邻的其他色谱峰的分离度应大于1.5。色谱图见图1。

图1 二甲基亚砜空白溶剂(A)、3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品(B)和供试品(C)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of dimethyl sulfoxide blank solvent(A),4-O-β-D-glucopyranosyl-3,3′,4′-tri-O-methylell agic acid(B)and test substance(C)

2.4 线性关系考察

分别精密吸取 3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶液1、2、5、10、15、20 和30 μL 注入液相色谱仪，按“2.3”项下色谱条件测定并记录相应色谱峰面积，以对照品进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程Y＝6.0×106X－1.910 5×104，r＝1.000 0。结果表明，3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷在0.02～0.60 μg 内其进样量与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

取同一批羊开口样品粉末（8 号样品）约2.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件连续进样6 次测定，计算得到3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量分数的RSD 为1.72%。

2.6 稳定性试验

取同一批羊开口样品粉末（8 号样品）约2.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0、1、2、4、8、24 h 按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算得到3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量分数的RSD 为2.53%。

2.7 重复性试验

取同一批羊开口样品粉末（8 号样品）约2.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，平行制备6 份，分别按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算得到3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的质量分数的RSD 为1.00%。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的同一批羊开口样品粉末（8 号样品）约1.0 g，平行6 份，精密称定，分别精密加入3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品溶液1.0 mL（质量浓度为0.25 mg/mL），按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算得到3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的平均加样回收率为105.58%，RSD 为2.27%。

2.9 样品测定

分别取15 批不同产地的羊开口样品粉末各约2.0 g，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样测定，计算各样品中3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量，结果见表2。由表2 结果可知，15 批羊开口样品中均可检出3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，但产地不同，样品中 3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量差异较大。造成各地区产生含量差异的原因，可能是因为广西地处中国地势第二阶梯中的云贵高原东南边缘，地势呈现西北向东南倾斜，地貌复杂多变，土壤酸性有差异，气候带较多，各地光照和气温不同，使羊开口的生长和3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的成分积累受多方面的影响。此外，羊开口的生长年限、采收期、产地加工方法不同，也会影响其含量。

表2 羊开口中3,3′,4′-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量测定结果（n＝2）Table 2 Determination of 4-O-β-D-glucopyranosyl-3,3′,4′-tri-O-methylellagic acid in Radix Melastomatis Normalis (n＝2)

3 讨论

本实验考察了不同提取方法（冷浸、超声和回流）、不同提取溶剂（甲醇、80%甲醇、80%乙醇和80%丙酮）、不同溶剂用量（20、25、50 mL）和不同提取时间（30、60、90 min），结果以80%丙酮25 mL 超声提取60 min 效率最高。

本实验考察了不同流动相（甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液）的洗脱效果。经实验，在其他色谱条件不变的情况下，采用乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相，所得色谱图中3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的基线较平稳，分离度、峰对称性最好，故选用乙腈-0.2%磷酸水溶液为本实验的流动相。

本实验曾采用PDA 检测器3D 模式在200～400 nm 对3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的对照品溶液进行全波长扫描，结果显示3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的最大吸收波长为246 nm，故选择246 nm 作为本实验的检测波长。

由15 批不同产地的羊开口药材的含量测定结果可知，3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量虽有波动，但均能有效检出，并且具有很好的药理活性，故将此成分作为羊开口的含量测定指标成分是有一定科学依据的。为了更好地控制羊开口药材的质量，建议继续深入开展不同产地、不同生长年限、不同采收期和不同产地加工方法的羊开口药材的3,3ʹ,4ʹ-三甲氧基鞣花酸-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的含量测定研究，以便积累数据，为制定科学的含量限度提供实验依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突