中国南瓜MLO基因的鉴定与表达分析

李 可, 金 辉, 陈 卓, 赵明明, 胡新燕, 李卫华, 陈晓光

(1.中国热带农业科学院南亚热带作物研究所,广东湛江 524091; 2.江苏徐淮地区徐州农业科学研究所,江苏徐州221000)

白粉病是南瓜发生最普遍、最严重的一种病害。南瓜白粉病是由单囊壳白粉菌(Podosphaeraxanthii)引起的。截至目前,国内外大量研究已鉴定出多个与植物白粉病抗性相关基因,其中一些已成功运用到抗病育种中,获得了一些抗病品种[1-4],这些基因为培育新的抗病品种提供了遗传材料[5-6]。R基因是最常见的一类抗病基因,具有专一高效的特点,缺点是容易因病原菌突变导致抗性丢失。另一类是负调控植物抗病性,参与植物感病的S基因,其功能缺失而产生植物抗病性,且与R基因相比抗性更稳定[7]。

自1942年在大麦中发现了第1个MLO基因突变体,大量学者对多种作物中的MLO基因进行了深入研究。研究发现,MLO基因是植物特有的一类由单基因控制的隐性抗病基因,MLO基因突变可诱导植物对白粉菌产生广谱、高效且持久的抗性。截至目前,已在多种植物中证实MLO基因是参与白粉病病菌侵染植物的感病因子。研究者利用生物技术手段沉默或突变大麦、拟南芥、烟草、小麦、番茄等植物中的相关MLO基因[8-12],可诱导它们产生广谱抗性。

中国南瓜全基因组测序工作的完成为MLO基因家族的鉴定奠定了基础,本研究利用生物信息学方法对中国南瓜MLO基因家族成员进行鉴定,分析其理化性质、结构特点、进化关系及白粉病的诱导表达模式,以期为中国南瓜MLO基因的功能验证及抗白粉病材料创制和新品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 中国南瓜MLO基因的鉴定与分析

利用已报道的近缘种的MLO蛋白序列在中国南瓜基因组数据库(http://cucurbitgenomics.org/organism/14)中进行相似性搜索(BLAST),其中包括拟南芥(Arabidopsisthaliana)、美洲南瓜(Cucurbitapepo)、印度南瓜(Cucurbitamaxima)。相关的MLO蛋白序列从数据库(http://cucurbitgenomics.org/organism/14;http://cucurbitgenomics.org/organism/8)中获取的中国南瓜MLO基因的CDS序列,利用BioXM2.7翻译成蛋白序列。获得的中国南瓜MLO蛋白序列通过Pfam数据库(https://pfam.xfam.org/)确认是否含有MLO基因的保守结构域[13-15]。相应的MLO基因序列也从中国南瓜基因组数据库中获取。

1.2 基因结构分析

利用在线软件GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)对基因结构进行分析,分析其外显子和内含子构成。ORF分析利用BioXM2.7软件完成[16-17]。

1.3 蛋白质结构特点分析

采用在线软件ExPASy(https://www.expasy.org/)对中国南瓜MLO蛋白序列进行理化性质分析,包括分子权重和等电点分析。利用在线软件TMHMM(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)进行跨膜区螺旋预测。氨基酸序列保守基序预测采用在线软件MEME(https://meme-suite.org/meme/)完成[18]。

1.4 多序列比对及进化树分析

对85个MLO氨基酸序列进行进化树作图,包括15个拟南芥、20个美洲南瓜、21个印度南瓜、20个中国南瓜以及已报道的4个单子叶植物的白粉病抗性相关MLO蛋白和5个双子叶植物抗病基因氨基酸序列。利用MEGA6采用Align by ClustalW进行多序列比对,采用最大似然法构建系统发育树。被划分到第Ⅴ分支的MLO蛋白序列利用DNAMAN进行多序列比对,鉴定该分支的保守氨基酸及基序[19]。

1.5 白粉病抗性相关基因的表达分析

感病和抗病材料为本研究前期筛选鉴定出的中国南瓜资源。抗感材料于2021年6月在江苏徐淮地区徐州农业科学研究所实验室的光照培养箱中种植,培养条件为30 ℃光照16 h,25 ℃黑暗8 h,于南瓜苗3叶1心期接种白粉病菌。白粉病菌取自江苏徐淮地区徐州农业科学研究所试验基地发病的大田南瓜叶片,挑取单菌落于吐温20中,制成2.5×105～5.0×105个/mL孢子悬浮液,喷施接种在健康的感病南瓜幼苗叶片上,置于25～30 ℃、湿度90%的光照培养箱中培养,经5次分离纯化后,收集白粉病菌孢子用于接种试验。接种后置于光照培养箱中,培养条件同上,分别于接种前(0 h),接种后12、24、48、72 h取样,液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱中保存。分别检测抗感材料中被划分到第Ⅴ分枝的MLO基因(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19)的表达量。

RNA提取利用翊圣 MolPure® Blood RNA Kit 植物RNA提取试剂盒,cDNA合成利用Takara PrimeScriptTMRT Master Mix试剂盒完成。基因的相对表达量采用TOYOBO SYBR® Green Realtime PCR Master Mix荧光定量试剂盒,反应程序:95 ℃,60 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 45 s,40个循环。利用ABIQuantStudioTM6 Flex进行荧光定量PCR。利用NCBI中的Primer-BLAST 设计引物,18S RNA作为内参[20-22]。

表1 荧光定量引物序列

2 结果与分析

2.1 中国南瓜中MLO基因的鉴定与分析

通过同源比对及鉴定,共获得20个中国南瓜MLO基因(表2),按照其在染色体上的分布命名为CmoMLO1到CmoMLO20。20个CmoMLO基因分布在除了5、10、11、12、14和19号以外的14条染色体上。其中1、2、3、4、13和20号染色体上分别有2个CmoMLO基因分布。鉴定结果表明,中国南瓜的CmoMLO基因数量与美洲南瓜及印度南瓜的MLO基因数量相当。中国南瓜CmoMLO基因大小从 2 965 bp 到9 967 bp不等,所编码的蛋白质氨基酸数量也从324个至1 264个不等,对应的等电点为6.26～9.63,分子权重为36 403.18～140 267.57 ku,外显子个数为6～22个(图1)。20个CmoMLO基因中有9个基因(CmoMLO2、CmoMLO5、CmoMLO8、CmoMLO10、CmoMLO14、CmoMLO15、CmoMLO16、CmoMLO18、CmoMLO20)含有15个外显子。20个CmoMLO基因编码的蛋白质氨基酸序列含有2～8个不等的跨膜区,其中12个CmoMLO蛋白(CmoMLO2、CmoMLO4、CmoMLO6、CmoMLO8、CmoMLO9、CmoMLO10、CmoMLO11、CmoMLO13、CmoMLO15、CmoMLO17、CmoMLO18、CmoMLO19)含有7个跨膜螺旋。利用MEGA6采用Align by ClustalW clustlW进行多序列比对,采用最大似然法构建系统发育树,20个中国南瓜CmoMLO蛋白被分为6个分枝。

表2 中国南瓜MLO家族基因的特征

2.2 第Ⅴ分枝氨基酸序列保守基序预测

利用在线软件MEME对来自不同作物的第Ⅴ分枝23个MLO氨基酸序列进行保守基序预测(图2),在参数设置为0.05显著水平条件下得到22个宽度6～50不等的保守基序,motif1、motif2和motif9是第Ⅴ分枝所有MLO蛋白序列都含有的保守基序,可能与双子叶植物白粉病抗性有关。

2.3 多序列比对及进化树分析

85个MLO蛋白聚类分析,分成7个分枝(图3),中国南瓜的20个MLO基因被划分到除第Ⅳ分枝外的6个分枝,其中5个被划分到第Ⅰ分枝(CmoMLO2、CmoMLO7、CmoMLO12、CmoMLO15、CmoMLO16),3个被划分到第Ⅱ分枝(CmoMLO11、CmoMLO17、CmoMLO20),3个被划分到第Ⅲ分枝(CmoMLO5、CmoMLO9、CmoMLO10),5个被划分到第Ⅴ分枝(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19),2个被划分到第Ⅵ分枝(CmoMLO1、CmoMLO14),2个被划分到第Ⅶ分枝(CmoMLO3、CmoMLO6)。已知的双子叶植物抗白粉病相关MLO蛋白均被聚类到第Ⅴ分枝。第Ⅳ分枝涵盖了所有已知单子叶植物白粉病抗性相关MLO蛋白。

为了揭示第Ⅴ分枝MLO蛋白的序列特点,利用DNAMAN进行多序列比对,鉴定该分枝MLO蛋白的保守氨基酸及基序。结果表明,该分枝的MLO蛋白的氨基酸序列含有7个跨膜结构域(TM1～TM7),且大部分成员的跨膜区氨基酸残基高度保守(图4)。

2.4 白粉病抗性相关基因的表达分析

为了检测中国南瓜白粉病抗性相关MLO基因,于接种后不同时间点取样,分别检测抗感材料中被划分到第Ⅴ分枝的MLO基因的表达量(CmoMLO4、CmoMLO8、CmoMLO13、CmoMLO18、CmoMLO19)(图5)。CmoMLO4在抗病材料中接种前后表达量无显著差异,感病材料中接种后24 h显著上调,其余几个时期与接种前表达量无显著差异。CmoMLO8在抗感材料中接种前后基因表达的整体趋势较一致,均在接种后12 h显著上调表达,而后表达量开始下降,但抗病材料中12、48、72 h基因上调表达,显著高于感病材料。CmoMLO13在抗病材料中接种后12 h显著上调表达,24、48 h与接种前表达量无显著差异,接种后72 h再次显著上调表达,感病材料中接种后24 h显著上调表达,48 h表达量下降,72 h 再次显著上调表达。CmoMLO18在抗病材料中接种后12、48 h显著上调表达。CmoMLO18在感病材料中接种前后表达量无显著差异。CmoMLO19在抗病材料中接种后12、48、72 h均显著上调表达。CmoMLO19在感病材料中接种后显著上调表达,且在24 h达到峰值。CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19可能参与了白粉病病菌侵染中国南瓜的重要相关基因,且在接种后24 h是白粉病侵染的关键时期。

3 讨论与结论

前人研究已证实,MLO基因家族的某些成员在白粉病病菌侵染植物的过程中充当“感病因子”,MLO基因的突变能够引发植物对白粉病的广谱抗性,因此MLO基因在植物抗白粉病育种中具有重要的意义。截至目前,葫芦科蔬菜作物中西瓜、甜瓜、黄瓜、印度南瓜、美洲南瓜、苦瓜等多种作物均已报道了对MLO基因家族成员的鉴定与分析[17,23-26],而关于中国南瓜MLO基因的鉴定与分析还未见报道。本研究采用生物信息学方法,利用中国南瓜基因组数据,共鉴定得到20个MLO基因,基因数量与印度南瓜(20个)和美洲南瓜(18个)相当[25-26]。印度南瓜的20个MLO基因分布在15条染色体上,而中国南瓜的20个MLO基因分布在14条染色体上,2个种中的5、10、11、12、14、19号染色体上均无MLO基因分布,其中1、2、3、4、13、20号染色体均有2个MLO基因分布,说明MLO基因在2个种中具有较高的保守性,同时又存在一定的变异性。对应的等电点为6.26～9.63,外显子个数为6～22个,有 2～8个不等的跨膜区,与葫芦科其他作物(西瓜、甜瓜、黄瓜、印度南瓜、美洲南瓜)一致性较高[23,25-26]。系统进化分析表明,中国南瓜MLO蛋白与已报道的葫芦科其他作物高度相似,均被划分成6个分枝。

目前的研究表明,双子叶植物中与白粉病抗性相关的MLO蛋白可能仅分布在第Ⅴ分枝,而单子叶植物中的相关基因仅位于第Ⅳ分枝,但这2个分枝上的基因并不都参与植物与白粉病病菌的互作[27]。因此通过人工接种试验鉴定中国南瓜第Ⅴ分枝相关MLO基因的表达量变化,发现CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19在感病材料接种后24 h显著上调表达,且上调幅度较高,而在抗病材料中上调表达不显著或幅度明显低于感病材料,说明他们可能是白粉病病菌侵染中国南瓜过程中的主要感病因子。CmoMLO8和CmoMLO18在抗感材料中表达量变化趋势整体上较一致,可能在抗感材料中参与了相似的生物学过程。CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19在接种感病材料后24 h表达量达到峰值,说明接种后24 h是基因与白粉病病菌互作的关键时期。颜惠霞对南瓜白粉病病原菌侵染过程进行观察发现,接种后24 h白粉病病菌芽管伸长,形成初生菌丝,接种后36 h分生出次级菌丝,接种后96 h串生的分生孢子形成[28]。白粉病病菌侵染黄瓜叶片也有类似的过程[29],本研究中基因表达量变化结果与该细胞学观察结果相吻合。后续研究中可通过基因敲除或沉默技术进一步验证CmoMLO4、CmoMLO13和CmoMLO19基因的功能。