基于形态标记和AFLP标记的山药种质资源遗传多样性分析

赵 圆, 张艳芳, 杨 帆, 赵令敏, 陈 妍, 霍秀文

(内蒙古农业大学园艺与植物保护学院/内蒙古自治区野生特有蔬菜种质资源与种质创新重点实验室,内蒙古呼和浩特 010019)

山药(DioscoreaoppositaThunb.)为合目薯蓣科薯蓣属,具备双子叶特征特性的单子叶缠绕草质藤本植物,无性繁殖。山药的主要产品器官为子叶下胚轴膨大形成的地下块茎,其地下块茎形状呈长圆柱形,垂直生长[1]。山药是纯天然的滋补保健食物,含有多种营养物质,可食用,也可药用,有调节脾胃、增强免疫、延缓衰老等效果,是世界上重要的十大食用块茎类植物之一[2]。我国是山药重要的原产地之一,在长期栽培过程中,因其适应性强、种植范围广,使得地区间相互引种,但山药的体外培养和遗传转化方案尚未建立,导致山药原有遗传基础已无法准确溯源,种质资源混乱,仅通过简单形态学标记很难真实反映品种间的遗传背景和亲缘关系,分类鉴定难度大,不利于山药产业的健康快速发展[3]。

以DNA为基础的分子标记是鉴定种质资源差异性最直接有效的遗传分析方法,不受基因表达和地理环境的影响。其中,AFLP是基于PCR开发且效率很高的标记技术,只需少量纯化的DNA,具有重复性好、稳定性强、灵敏度高等优点,极大地加快了育种进程[4]。许云等通过AFLP分子标记分析了111份大薯材料的遗传多样性,8对引物组合共扩增出1 286个多态性位点,占总位点数的99.61%,表明AFLP标记可以检测出大薯较高的多态性,有效地分析材料间的遗传关系[5]。Mengesha等采用AFLP基因指纹图谱对43株不同群体的几内亚山药进行鉴定,分析发现,几内亚山药栽培品种间存在种内高度变异和种间低程度变异[6]。王丹等对21份马铃薯材料进行AFLP分析,并构建了能区分所有材料的指纹图谱[7]。本研究通过AFLP分子标记结合形态标记的方式,对60份山药种质资源进行聚类及遗传多样性分析,以进一步揭示山药种质资源遗传多样性及亲缘关系,以期为今后山药种质资源的分类及优良品种的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与来源

供试材料为笔者所在课题组近年从河南省、河北省、山东省等山药主产区收集到的60份山药种质资源,均种植于内蒙古呼和浩特市内蒙古农业大学种质资源圃,土质疏松,无石块,肥力适中,无连作。山药种质基本信息见表1。

表1 供试山药材料编号及来源

1.2 试验方法

1.2.1 主要形态指标调查 按照山药的生物学特性,在山药生长发育旺盛期和收获期,分别观察、计算山药植株的地上部和地下部形态特征指标,具体参照许念芳等的测定方法[8]。形态多样性调查的主要指标及赋值标准见表2。

表2 形态多样性指标及赋值标准

1.2.2 DNA提取 2020年8月采集生长旺盛期健康、无病虫害的山药幼嫩叶片,装入事先准备好的冻存管,迅速放入装有液氮的采样盒中,保持叶片新鲜,采集后立即进行DNA提取。山药DNA的提取和浓度检测详见张佳佳等的方法[9]。

1.2.3 主要试剂及引物 参考孙瑞芬等的方法[10]设计接头和引物序列(表3)。选择性扩增引物由预扩增引物EcoRⅠ和MseⅠ序列末端加任意的3个碱基组成,各设计16个,共组合256对。

表3 接头和引物序列

1.2.4 AFLP扩增及检测 首先选用3个山药品种(海口山药、日本山药-2、河南山药-1)进行引物筛选,从256对引物中筛选出多态性较好的引物组合,然后进行60份材料的整体试验。

1.2.4.1 酶切与连接 选用限制性内切酶EcoRⅠ和MseⅠ对植物组DNA进行双酶切,酶切体系为:10×NEB Buffer 5 μL,EcoRⅠ/MseⅠ 2 μL,模板DNA1 μg,补ddH2O至50 μL。PCR程序为37 ℃温育 10 min,65 ℃温育20 min。

分别制备EcoRⅠ接头和MseⅠ接头:将E1(10 μmol/L)和E2(10 μmol/L)各10 μL于微量离心管中混匀,取另一离心管将M1(10 μmol/L)和M2(10 μmol/L)各10 μL混匀。PCR程序均为 95 ℃ 5 min,65 ℃ 10 min,37 ℃ 10 min,25 ℃ 10 min,4 ℃ 20 min。

连接体系为20 μL:T4DNA Ligation Buffer 2 μL,T4DNA Ligase(3 U/μL)0.5 μL,EcoRⅠ接头/MseⅠ接头 2 μL,酶切产物10 μL,ddH2O 5.5 μL。16 ℃连接过夜。

1.2.4.2 预扩增 将连接产物稀释10倍作为预扩增模板,预扩增反应体系20 μL:rTaq酶10 μL,M0/E0 2 μL,10×连接产物2 μL,ddH2O 6 μL。PCR程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,56 ℃退火 60 s,72 ℃延伸60 s,30 次循环;72 ℃延伸10 min。

1.2.4.3 选择性扩增 参照王志敏等对山药块茎不同发育时期相关差异基因的cDNA-AFLP分析中的反应体系及反应条件[11]进行选择性扩增。

1.2.4.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 选择性扩增产物95 ℃变性后经过8%聚丙烯酰胺凝胶电泳,强碱法银染显色至出现清晰条带,拍照保存,统计条带。

1.2.5 数据处理与分析 利用SPSS 25.0软件计算15个质量性状的分布频率;6个数量性状的最小值、最大值、平均值、标准差、变异系数;参照吴金平等的方法[12]计算Shannon-Wiener多样性指数。采用DPS分析软件中非加权类平均法对60份山药种质进行Q型聚类分析,从中分析各材料的亲缘关系。根据AFLP扩增条带,构建“0、1”矩阵(有带为1,无带为0),利用POPGEN 32软件统计多态性条带数、有效等位基因数(Ne)、Shannon信息指数(I)等遗传多样性指数。使用NTSYS 2.1软件计算不同材料间的遗传相似性系数,并根据遗传相似系数用UPGMA法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 山药种质资源形态性状多样性

对60份山药种质资源的21个性状进行分析,不同性状在不同材料间表现出不同的多样性。由表4可知,在15个质量性状中,除叶的缺裂均为浅裂外,其他14个质量性状在不同级别上分布不均匀,遗传多样性指数最高的是叶形,为1.273 9,其次为叶色(1.000 0)。由表4可知,茎蔓以右旋为主;茎蔓颜色以紫色为主;茎蔓截面形状以圆形为主;叶形多为戟形、心形;植株长势中等;大多数无零余子;块茎形状以棍状为主;块茎表皮颜色以黄褐色为主;块茎肉色多为白色;块茎龙头多为细长型;块茎须根数100以上。由表5可知,6个数量性状具有不同差异,块茎质量的变异系数最大,达到75.88%,叶长变异系数最小,为12.43%。各数量性状变异程度为块茎质量>块茎直径>叶炳长>块茎长>叶宽>叶长。

表4 15个质量性状的分布及多样性指数

表5 6个数量性状的统计分析

2.2 山药种质资源形态性状的聚类分析

对60份山药种质的田间形态数据进行系统聚类分析,结果如图1所示。60份山药种质的欧氏距离为1.081 6～11.425 9,说明所选材料的遗传多样性丰富。其中日本山药-2(6)和日本山药-3(31)之间遗传距离最小,为1.081 6, 两者间遗传差异相对较小;大和长芋(22)和得泽红皮山药(57)之间遗传距离最大,为11.425 9,两者间遗传差异相对较大。当遗传距离为8.18时可将供试材料分为两大类,河南焦作山药(2)和沈阳草河口山药(39)聚为一类,其他58份种质聚为一类,这2份种质的主要特征为茎蔓截面形状为方形,而其他材料均为圆形。当遗传距离在7.36时可将供试材料分为3个类群和一个单独分支,大和长芋(22)单独聚为一类,其主要特征为叶形较大、植株长势强、有零余子、块茎短粗产量高;云南品种曲靖山药(29)、播乐赖皮山药(49)、德泽红皮山药(57)聚为第一亚类,主要特征为茎蔓左旋、叶炳绿色、叶片为浅绿色心形、无零余子、块茎表皮白色、薯肉白色、须根数100以上;其余材料聚为第二亚类。

2.3 AFLP扩增结果分析

选用3个山药品种从256对引物中筛选出26对清晰且多态性较好的引物组合(表6),分别对60份材料进行选择性扩增,共获得多态性条带580条,平均每对引物扩增22条多态性条带,片段大小主要集中在100～750 bp之间,平均多态率78.44%,其中扩增条带数最多的引物组合是E-GCT/M-GAC;扩增条带数最少的引物组合是E-GCT/M-TGC。扩增多态率最高的是引物组合E-GCT/M-ACG,达到97.50%;扩增多态率最低的是引物组合E-CAG/M-AGT,为62.96%。Nei’s基因多样性指数在0.111 5～0.335 5之间,平均值为0.198 8;Shannon信息指数在0.188 7～0.503 9之间,平均值为0.314 9,表明供试山药种质具有较高的遗传多样性。图2为引物组合E-GTT/M-TTC扩增后的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。

表6 26对引物组合扩增产物多态性分析

2.4 聚类分析

采用NTSYS2.1.0软件计算60份山药种质的遗传相似系数,用UPGMA法进行聚类分析(图3)。60份山药材料之间遗传相似系数为0.619～0.922,表现出丰富的多样性和相似性,其中温县铁棒山药(3)和细毛山药(8)遗传相似系数最大,为0.922,表明两者间遗传差异较小;广淮(10)和德泽红皮山药(57)遗传相似系数最小,为0.619,表明两者间遗传差异较大。

在遗传相似系数为0.68时,60份山药种质除广淮(10)外,其他聚为一大类群,表明广淮与其他种质间虽有共同的遗传基因,但遗传相似系数相对较小,存在较大的遗传差异。在遗传相似系数为0.74时,可将第一大类群分为2个亚类群和一个单独分支,淮山药(33)较为特殊单独聚为一类,来源于云南地区的会泽山药(46)、云南富民山药(37)、播乐赖皮山药(49)、得泽红皮山药(57)聚为第一亚类,其他材料聚为第二大亚类。

3 讨论与结论

形态学标记是通过观察植株的表型性状来区分品种间差异,是评价种质遗传多样性最简单直观的方法,但易受外界环境和内在遗传变异的影响[13]。本试验对60份山药种质21个表型性状进行分析,在15个质量性状中,除叶的缺裂均为浅裂外,其他14个质量性状存在不同程度差异,遗传多样性指数最高的是叶形,其次为叶色;6个数量性状平均变异系数为30.07%,块茎质量的变异系数最大,叶长变异系数最小。通过形态学聚类发现欧氏距离为1.081 6～11.425 9,说明试验所选材料表型差异大,遗传多样性丰富。杨明通过对30份山药材料的13个形态指标进行分析,表明块茎长、块茎周长和叶形3个形态指标是彼此独立的,对山药的生长进化各有其重要意义,可以作为山药形态学分类的标准[14]。李丽红等对福建72个山药地方品种资源的19个主要农艺性状进行遗传多样性分析,其中12个质量性状遗传多样性指数均介于0.738 3和1.568 3之间,平均值为1.017 3,叶片质地较高,零余子及是否开花较低,7个数量性状的平均变异系数为33.17%[15],本试验结果与之相近,说明山药群体中存在丰富的表型变异。覃维治等根据表型性状的遗传差异将44份淮山药种质分为4类,性状相近且区域内生态环境相似的材料聚为一类,各个类群都存在着相应的形态学特征,12个质量性状中,叶形的遗传多样性指数最高[16],本试验结果与之一致,说明在通过表型性状研究山药遗传多样性时,除块茎粗、块茎长、块茎质量这些对山药产量起决定作用的指标外,叶形特点也具有重要的研究意义。参照《中国植物志》[17]有关山药的信息及前人的一些研究,根据本试验所收集到的数据,如叶片特点上可将本试验中所用到的材料区分为薯蓣、参薯、日本薯蓣这三大类,薯蓣的叶片小至中、绿色、叶形为戟形、心形或三角形;参薯的叶片中至大、浅绿色、叶形多为心形;日本薯蓣叶片较大、深绿色、心形或三角形。其中参薯包括广淮、曲靖山药、德泽红皮山药、播乐赖皮山药、会泽山药、云南富民山药,日本薯蓣包括日本山药-2和日本山药-3,其他山药材料为薯蓣。

分子标记是从DNA水平直接反映品种间差异,普遍认为是最有效的遗传标记方法[18-19]。本试验用筛选出多态性较好的26对引物组合扩增出多态性条带580条,平均每对引物扩增出22条多态性条带,平均多态率78.44%;Nei’s基因多样性指数、Shannon 信息指数平均值为0.198 8和0.314 9,遗传相似系数在0.619～0.922之间,表现出材料间有丰富的多样性和相似性。在遗传相似系数为0.74时,可将60份山药种质分为2个类群和2个单独分支(广淮、淮山药),广淮在聚类树状图的根基处自成一类,根据形态特征和聚类分析应属于参薯,主要分布在广东,与其他地区相比广东地区长夏无冬,降水充沛,农作物的生育期较长,可能在长期的生长发育过程中为适应环境产生了变异,易区别于其他品种;淮山药在聚类中单独分为一类可能由于其叶片较大、块茎较小,与其他薯蓣种质差别较大造成的。Wu等对21个山药地方品种进行遗传多样性分析,ISSR和SRAP的多态性分别为95.3%和93.5%,表明这些地方品种间存在较高的多态性[20]。华树妹等利用RAPD标记方法对采集自福建各地的34份山药资源进行遗传多样性研究,24对引物多态性比例达88.5%,当遗传系数为0.66时,将34种资源划分为扁山药、普通山药、福建大薯和参薯4类[21]。

本试验采用形态学标记和AFLP分子标记2种方法聚类分析了60份山药种质资源的遗传多样性。研究发现,山药种质资源的形态聚类方式和AFLP标记聚类方式存在一定差异,形态学聚类结果显示,当遗传距离为8.18时可将供试材料分为两大类,茎蔓截面为方形的2份材料河南焦作山药(2)和沈阳草河口山药(39)与其他58份种质分开,这两者形态有相同特点但在基因水平不是特别相近,通过分子标记可将这2类种质区分开,表明DNA分子标记更能直接、准确地将山药种质资源分类。部分山药种质在2种聚类图上都被聚到了一起,如日本山药-2(6)和日本山药-1(31)、河南山药-2(32)和河南铁棍-2(34)、太谷山药-2(58)和山西山药(59)相似系数都在0.800 0以上,表明它们之间可能是近缘关系或同一品种的不同品系经过地区间引种、人为定向选择产生了种内变异,但遗传相似度仍较高。当形态聚类遗传距离在7.36时可将云南薯蓣中曲靖山药(29)、播乐赖皮山药(49)、德泽红皮山药(57)从其他资源中分出,而当分子聚类遗传系数为0.716时,将来源于云南地区的会泽山药(46)、云南富民山药(37)、播乐赖皮山药(49)、得泽红皮山药(57)从其他材料中分出,其主要特征为茎左旋、叶片浅绿色心形、不着生零余子、薯块表皮和肉色均为白色,说明这些云南薯蓣无论从形态还是分子水平都与其他材料有着明显差异,但单独用一种标记方法很难将它们相互之间准确分开,而使用形态和分子结合的方法则可以将它们更好地区分开。该分类也与刘向宇利用表型性状和ISSR分子标记方法对山药种质资源分析所得到的结果[22]相似。黄姗通过SRAP标记聚类分析将94份山药资源分为5类,其中前4类分别为薯蓣、褐苞薯蓣、山薯和参薯,与形态特征分类一致,而第5类的3份资源按形态分类属于参薯类,在分子标记聚类分析中则自成一类,与其他参薯相比较存在特殊形态特征,表明分子标记研究种质资源较高准确性[23]。通过聚类分析发现,本试验所选材料普遍为北方地区种植的薯蓣,缺少广东、广西主栽品种山薯和广西、福建等地区的褐苞薯蓣,并不能代表我国所有山药种质的遗传背景,今后应多收集全国不同地区不同品种的山药材料加以分析研究。形态学研究和分子研究结果存在差异在于它们在不同层面上表现植物的遗传多样性,形态学研究根据植物的表型性状来区分遗传变异和品系差异,而分子标记直接体现了种质之间的基因型差异,与基因表达和环境条件无关,因此其亲缘关系分析结果更准确[24]。山药具有很强的区域性,不同生态区域对同一种质的生长发育和形态特征有较大影响。因此,在遗传多样性研究中,选择形态学标记与分子标记相结合,有助于更客观、更准确地确定种质资源间的特异性。