不同苹果品种白粉病田间抗性与遗传多样性分析

郑 伟, 吴亚维, 宋 莎, 罗昌国, 王 彬

(贵州省农业科学院果树科学研究所,贵州贵阳 550006)

苹果白粉病病原为白叉丝单囊壳(Podosphaeraleucotricha),属于子囊菌亚门叉丝单囊壳属,无性阶段(Oidiumsp.)属半知菌类真菌,在我国苹果产区发生普遍[1]。该病也是贵州省威宁县苹果生产中的主要病害之一,芽、嫩梢、花、叶及幼果都会受到侵染,严重影响树势,降低产量,严重制约威宁县优质苹果产业的发展[2]。

韩婷婷等以白肉苹果金冠为母本、红肉苹果红勋1号为父本杂交获得的F1代为试材,对杂交后代的性状进行遗传多样性分析[3]。李政等以18个新疆野苹果优系、23个鲜食苹果品种和7个苹果砧木品种为材料,对3类苹果资源的遗传多样性及亲缘关系进行分析[4]。侯丽媛等以山定子和25份苹果栽培品种为试验材料,利用16 对荧光SSR 分子标记对供试材料进行分子鉴定,同时进行了遗传多样性分析,并构建了各供试材料的指纹数据和分子身份证[5]。索相敏等利用TRAP(target region amplified polymorphism)分子标记对苹果属30 个种和梨属3 个种共33 份材料进行了遗传多样性分析[6]。侯丽媛等利用TP-M13-SSR 技术对供试材料进行指纹图谱构建,在此基础上采用GenAlEx 6.501 软件对供试材料进行亲缘关系和遗传多样性分析,利用Ntsys 软件基于Jaccard 系数进行了UPGMA聚类分析[7]。侯丽媛等以赤霞及其亲本和部分苹果栽培品种为试验材料,利用16 对荧光SSR 分子标记进行分子鉴定的同时构建了指纹图谱,并进行了遗传多样性分析[8]。于少帅等利用15 对特异性SSR 引物对290 份新疆野苹果和栽培苹果样品进行扩增,并通过分子生物学方法分析其遗传变异特征与系统发育关系[9]。苏艳丽等做了SSR标记的开发在苹果遗传多样性中的应用研究[10]。高源等对苹果属15 个种的叶绿体DNA变异与遗传分化进行了研究,对苹果属植物种质多样性的 SLAF-seq 进行了分析[11-12]。有多位学者对苹果树腐烂病、茎沟病毒、褪绿叶斑病毒、褐斑病、炭疽病等的遗传多样性进行了分析[13-17]。虽然前人在以上方面研究很多,但在不同苹果品种白粉病田间抗性与遗传多样性相关性方面报道还很少。采用ISSR分子标记对16份苹果送检样品进行了DNA鉴定,建立供试种质的DNA指纹图谱数据库,并对白粉病田间抗性进行评价和遗传多样性分析,了解不同苹果品种间亲缘关系以及与白粉病抗性之间关系,以期为抗性利用、病害防治和新品种选育等提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鉴定材料详细信息见表1。

表1 材料编号及名称

取样时间:2017年5月18日;取样地点:威宁县雪山镇新街果园。

1.2 检测方法和调查方法

1.2.1 DNA的提取及检测 采用天根生物科技(北京)有限公司的新型植物基因组DNA提取试剂盒(DP320-03)提取样品DNA,操作方法参考试剂盒使用说明,1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量后,-20 ℃储存。

1.2.2 PCR扩增 从33条ISSR引物中筛选出19条谱带清晰、多态性较好的引物进行PCR扩增,引物序列及其退火温度见表2。PCR反应体系为 10 μL:3.0 μL ddH2O;0.8 μL 10 μmol/L ISSR引物;1.2 μL 50 ng/μL DNA模板;5.0 μL 2×TaqPCP Master Mix;最后加1滴石蜡油防止蒸发。

表2 ISSR引物序列及退火温度

PCR反应程序:94 ℃预变性4 min;94 ℃变性30 s,40～56 ℃退火45 s(退火温度随引物而异),72 ℃ 延伸90 s,35个循环;最后72 ℃延伸5 min。

1.2.3 电泳检测 取5 μL PCR扩增产物,在含GoldviewⅠ型核酸染色剂(0.6 μg/mL)的1.5%琼脂糖凝胶中以110 V的恒定电压电泳50 min,以DL2000[天根生化科技(北京)有限公司]为标准分子量对照,然后在紫外凝胶成像系统中观察,将所成图像拍照保存。

1.2.4 发病情况调查 在苹果叶片采集的当天,对园内的各品种进行白粉病的发病情况调查。

1.2.5 数据统计 ISSR扩增产物按在相同迁移位置上(相同分子量片段)有带记为“1”,无带记为“0”,全部以1、0统计建立数据库,转换为数值矩阵后,用NTSYSpc 2.10e分析软件中的Qualitative data进行矩阵分析和SAHN Clustering计算相似系数,并按UPMGA法构建亲缘关系树状图。

2 结果与分析

2.1 DNA指纹图谱

筛选出的19 条引物均能扩增出1条以上的清晰条带,引物的有效扩增率达到了100%,共扩增出101条谱带,多态性谱带83条,送检样品的指纹图谱详见表3,图1为引物835的扩增谱带。

表3 送检样品DNA指纹图谱

2.2 样品间的亲缘关系

利用19条引物进行PCR扩增获得的标记信息,计算16份苹果样品的相似性系数。结果表明,被测样品间相似系数范围为0.56～0.93,遗传相似系数见表4。从图2可以看出,在遗传距离0.63处供试材料被分成2大类,第1类只有1份材料,为翠秋;第2类包括15 份材料,其中以遗传距离0.72 为阈值,该类分为5 小类,其中凉香的季节、王富、96-1、华富、布瑞本、凉香、华红、皮诺娃聚在一起,说明这几个品种亲缘关系较近;天红2号、红富士、蜜脆、红露聚到了一起,说明这几个品种亲缘关系较近;红盖露、王林、玉华早富都是单独的一类,说明这几个品种都与其他品种的亲缘关系较远。样品7号(凉香的季节)与8号(王富)的的遗传距离最小,亲缘关系最近,相似系数为0.93;样品1号(脆秋)与12号(王林)的遗传距离最大,亲缘关系最远,相似系数为0.56。

表4 苹果样品间遗传相似系数

2.3 不同品种亲缘关系与苹果白粉病抗性的相关性

从图3和表5可以看出,天红2号属于高抗品种,王林属于中抗品种,凉香的季节、王富属于抗病品种,96-1、华红、红富士属于感病品种,红露、华富、凉香、玉华早富、布瑞本、翠秋、皮诺瓦、蜜脆属于中感品种,红盖露属于高感品种。从图2和图3可以看出,凉香的季节与王富亲缘关系最近,对苹果白粉病抗性的差异也较小,都属于抗病品种。而凉香的季节、王富、96-1、华富、布瑞本、凉香、华红、皮诺娃这几个品种亲缘关系较近,但对苹果白粉病抗性的差异却相差很大,脆秋与王林的亲缘关系最远,但对白粉病的抗性差异却不是最小的。由此可见不同苹果品种对白粉病的抗性与亲缘关系的远近没有太大的相关性。

表5 抗白粉病鉴定分级

3 讨论与结论

ISSR是在微卫星标记的基础上发展而来的分子标记技术[18],能够揭示植物的遗传多态性,有效反映出品种间的亲缘关系[19]。其引物容易设计,开发费用低,PCR条件更为严谨,试验重复性强,操作过程简单,不需使用同位素,可以揭示更高程度的DNA多态性[20]。目前ISSR分子标记技术已被广泛应用在果树、蔬菜、食用菌、茶叶、中药材、花卉等植物上进行遗传多样性分析、亲缘关系鉴定以及构建遗传连锁图谱等方面[21-31]。研究结果表明,ISSR标记技术是一种非常可靠的有效工具,在苹果树种上,ISSR 标记技术主要应用在杂交后代与亲本遗传[32-33]、芽变鉴定[34-35]、砧木资源遗传多样性[36-37]、病菌基因多态性的ISSR分析[38]、栽培品种ISSR分析[39]和指纹图谱构建[40]等。本研究利用ISSR 分子标记技术研究在贵州威宁苹果园内种植的16 份苹果栽培品种的遗传多样性,筛选出的19条引物均能扩增出1条以上的清晰条带,引物的有效扩增率达到了100%,共扩增出101条谱带,其中多态性谱带83条,多态性比率为82.18%,表明这19条ISSR引物能够用于16个苹果品种的遗传关系分析。进一步遗传分析表明,在标记检测范围内,16份苹果样品表现出遗传差异性,其遗传距离在0.56～0.93。聚类分析显示,以相似系数0.63为标准,可将供试的16份苹果品种划分为2大类,第1类只有1份材料,为翠秋;第2类包括15份材料,其中以遗传距离0.72为阈值,该类分为5小类,其中凉香的季节与王富的遗传距离最小,亲缘关系最近,相似系数为0.93;脆秋与王林的遗传距离最大,亲缘关系最远,相似系数为0.56。但总的来说,遗传多样性分析发现群体的相似系数普遍较高,这表明筛选出的ISSR 引物具有一定的代表性,可为之后苹果的品种资源多态性及抗病性的鉴定提供一定的参考。而不同品种田间抗性的调查数据和亲缘关系的分析数据显示,不同苹果品种对白粉病的抗性与亲缘关系的远近没有太大的相关性。