基于液相色谱质谱联用技术的儿童免疫性血小板减少症血浆代谢组学研究①

徐文鑫,肖慧婷,曾渊君,翁开枝,王尔莉,张春斌

(1.漳州卫生职业学院医学技术系,福建 漳州 363000;2.福建医科大学附属漳州市医院,福建 漳州 363000)

儿童ITP临床诊断依据仍然是结合病史、体格检查和排除血小板减少症其他病因的临床实验室病理检查[6]。临床实验室辅助诊断指标主要有血小板计数、骨髓巨核细胞检查、血小板生存时间及血小板相关免疫球蛋白(PAIg)。但这些指标在临床应用上都有不足。血小板计数特异性差;血小板生存时间检测方法复杂;骨髓巨核细胞检查需患儿承受骨穿痛苦;PAIg与ITP诊断的符合率不高。因此,对于儿童ITP,目前缺乏较好的临床实验室生物指标。本研究基于液相色谱-质谱串联分析技术(LC-MS)进行非靶向代谢组学分析,揭示ITP患儿血浆样本中的代谢物变化,希望能寻找到ITP患儿血浆中潜在可作为ITP诊断和鉴别诊断的临床实验室生物标记物,也为ITP发病机制提供进一步研究的思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2020-01～2021-01从福建医科大学附属漳州市医院儿科招募了未经任何治疗的ITP患儿20例和健康儿童19例。ITP患儿平均年龄4.8岁,男10例,女10例;健康儿童平均年龄5.68岁,包括男7例和女12例。两组在年龄和性别上的分布不存在显著性差异(P>0.05)。对于ITP的诊断标准严格按照中国儿童原发性免疫性血小板减少症诊断与治疗改编指南(2021版)[2]进行诊断,诊断标准如下:(1)至少2次血常规检查示血小板计数减少(<100×109/L),外周血涂片血细胞形态无明显异常;(2)脾脏一般不增大;(3)骨髓检查示巨核细胞增多或正常伴成熟障碍;(4)排除其他继发性血小板减少症。

1.2 样本采集与处理

使用真空采血管(无抗凝剂)采集清晨空腹患儿及健康儿童约5mL静脉血,避免溶血。血液标本2500rpm离心10min,吸取上清液(血浆)至已标记的样品管中,-80℃冰箱保存用于检测分析前处理。

1.3 仪器与试剂

仪器主要有液相色谱仪(Thermo,UltiMate 3000)、质谱仪(Thermo,Q Exactive)、色谱柱(ACQUITY UPLC®HSS T3 1.8μm,2.1×150mm)、真空浓缩仪(eppendorf,5305)、冷冻离心机(湘仪,H1650-W)、混匀仪(Vortex Mixer,QL-866),试剂包括甲醇和乙腈(色谱纯,Thermo)、甲酸(色谱纯,TCL)、 2-氯苯丙氨酸(色谱纯,Aladdin)、甲酸铵(色谱纯,Sigma), 实验用水为超纯水(由Milli-Q 超纯水机制备)。

1.4 样本制备

从-80℃冰箱取出样本,在4℃下融解。自每份样本中吸取100μL放入2mL离心管,再取400μL甲醇加入各支离心管,60s振荡混匀,离心5min(4℃,12000rpm);离心后将全部上清液移至2mL新离心管,真空浓缩干燥;用2-氯苯丙氨酸(4 ppm)80%甲醇溶液150μL复溶,上清液经0.22μm膜过滤,获得待检样本;每份待检样本各取20 μL混合制备成QC样本,余存待检样本用于LC-MS检测。

1.5 色谱-质谱条件及分析

色谱条件:色谱分离在配备ACQUITY UPLC®HSS T3 (150×2.1mm, 1.8μm, Waters)柱的Thermo Ultimate 3000系统中完成,保持40℃柱温。流动相采用正离子模式0.1%甲酸水(C)- 0.1%甲酸乙腈(D);负离子模式 5 mM 甲酸铵水(A)-乙腈(B)。自动进样器温度设为8℃,流速设为0.25mL/min,2μL进样梯度洗脱,洗脱程序:2% B/D,0～1min;2%～50%B/D,1～9 min;50%～98% B/D,9～12min;98% B/D,12～13.5min;98%～2% B/D,13.5～14min;正模式-2% D,14～20min(负模式-2% B,14～17min)。

质谱条件:采用电喷雾离子源(ESI)正负离子电离模式,正离子喷雾电压3.50 kV,负离子喷雾电压2.50 kV;鞘气30arb,辅助气10arb;毛细管温度设为325℃,分辨率设为70 000,m/z 81～1 000范围内全扫描;采用HCD模式以碰撞电压30eV进行二级裂解,并通过动态排除去除无必要的 MS/MS信息。

1.6 统计学方法

采用Proteowizard软件将检测得到原始数据转换成mzXML格式,通过R(v3.3.2)XCMS程序分析获得质核比(mass to charge ratio, m/z)、保留时间(retention time,rt)、峰面积(intensity)等信息的数据矩阵;并进行峰面积的批次归一化及标准化处理。采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、正交-偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)对各组数据进行归类,去除重复性差的样本和异常样本,并得到VIP值。采用秩和检验得到P值,根据P值和VIP值筛选出具有统计学意义的差异代谢物。通过人类代谢组数据(human metabolome data base HMDB)等数据库进行代谢物结构鉴定。经层次聚类(hierarchical clustering)分析形成热图,观察两组之间的差异代谢产物分类情况。经单变量受试者工作特征(ROC)曲线进一步评价并筛选潜在的生物标记物。采用KEGG数据库对差异性代谢物进行通路富集分析。P<0.05为差异有统计学意义。所有统计分析和绘图均采用R软件进行。

2 结果

2.1 样本检测数据分析

使用LC-MS/MS在正负离子模式下检测分析血浆样本,通过Proteowizard软件将获取的原始数据转换成mzXML格式,利用R(v3.3.2)的XCMS程序经峰识别、峰过滤、峰对齐及峰面积批次归一化,获得正离子模式下5334 个前体分子、9567 个前体分子,导出数据至excel进行后续分析。

2.2 主成分分析

通过对数据进行自适(UV) 换算处理,对标准化数据进行PCA,分别得到正负离子模式下PCA得分图(图1 A-B),图中每个点代表一个样本。其中QC组密集分布,说明方法稳定性良好数据质量良好,得到的数据可靠。同时ITP患儿组和健康对照组明显区分开,同组样本聚类,表明ITP患儿和健康儿童样本之间存在代谢差异。

图1-A 正离子模式下的得分图

图1-B 负离子模式下的得分图

2.3 差异代谢物筛选

应用秩和检验分析ITP患儿组和健康对照组的大量数据,得到p值。通过OPLS-DA得到正负离子模式下具有很高模型解释率的OPLS-DA区分模型(图2 A-B),并得到VIP值。为了在两组间找到差异显著的代谢物,本研究设定P<0.05且VIP>1,在ITP患儿组和健康对照组之间,正离子模式下共找到1199个差异代谢物, 在负离子模式下共找到1453个差异代谢物。

图2-A 正离子模式OPLS-DA的得分图

图2-B 负离子模式OPLS-DA的得分图

2.4 重要差异代谢物鉴定及聚类分析

将筛选出的差异性代谢物的MS/MS模式所得碎片信息在HMDB等数据库中进行匹配检索。设定数据库中的数值与检测得到的mz差异小于0.01Da,共鉴定出了90个差异代谢物的结构。对90个差异代谢物进行层次聚类分析,见图3,从结果可以看到,90个差异代谢物在ITP患儿组和健康对照组之间存在具有明显差异。计算90个差异代谢物在ITP患儿组和健康对照组两组之间的Fold change值,设定Fold change>6.00或<0.166,从中遴选出20种能很好区分ITP患儿组和健康对照组的重要差异代谢物,见表1。

图3 差异代谢物聚类分析树状图 (红色)ITP患儿组 (蓝色)健康对照组

表1 ITP患儿与健康儿童血样中的重要差异代谢物鉴定

2.5 关键差异代谢物的发现

应用ROC曲线分析方法,得到20种重要差异代谢物的ROC曲线结果,见图4。设定ROC曲线下面积值(AUC)>0.9,共选出13种潜在的关键差异代谢物,其中鉴定出5个内源性代谢物:间甲酚(m-Cresol)、腐胺(Putrescine)、5-羟色胺(Serotonin)、2-氧代精氨酸(2-Oxoarginine)、精氨基琥珀酸(Argininosuccinic acid)。绘制ITP患儿组和健康儿童组样本中5种内源性潜在关键差异代谢物的均值柱形图,见图5,发现5种代谢物在ITP患儿组和健康儿童组差异非常显著(P<0.001)。其中腐胺、2-氧代精氨酸、 精氨基琥珀酸在ITP患儿组是升高的,而5-羟色胺、间甲酚在ITP患儿组是降低的。结合上述统计学分析,最终选定精氨基琥珀酸、腐胺、2-氧代精氨酸、5-羟色胺、间甲酚这5种代谢物为ITP患儿的潜在生物标记物。

图4 20个重要差异代谢物的ROC曲线图

图5 5种内源性潜在关键差异代谢物在ITP患儿和健康儿童血样中的均值柱形图注:蓝色柱代表ITP患儿组,红色柱代表健康儿童组 (***表示P<0.001)。

经KEGG数据库对ITP患儿差异性代谢物的代谢通路进行分析。结果表明,ITP患儿差异代谢物富集于10条代谢途径:精氨酸和蛋氨酸代谢、亚油酸代谢、ABC转运蛋白、癌症中的中枢碳代谢、精氨酸生物合作、半胱氨酸和蛋氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢、蛋白质消化吸收、泛酸和辅酶A的生物合成等。

3 讨论

原发性免疫性血小板减少症(ITP)是一种以血小板破坏增加和血小板生成障碍导致的单纯血小板减少为特征的获得性自身免疫性疾病。目前针对ITP尚无明确的诊断方法,仍采用排除性诊断,在排除了血小板减少的其它病因后进行诊断[7]。寻找一种可靠的诊断方法将有助于ITP的诊断、鉴别诊断和药物治疗。代谢组学是通过对生物样本中代谢组分的定性和定量分析,研究代谢过程,确定具有代谢特征的关键生物标志物和揭示代谢机制的有力工具。如Wei Zhong等[8]应用LC-MS技术寻找急性冠脉综合征的血浆标志物,发现磷脂酰乙醇胺溶酶16:0与LPC(20:4)联合检测的AUC值达到0.905,有助于ACS的有效诊断;Fan Yang等[9]通过对多发性硬化(Multiple sclerosis MS)的代谢物变化与炎症因子的相关性分析,发现MS代谢组的改变可能通过调节外周的免疫炎症反应参与了MS的发病和病程;Liu等[10]用LC-MS技术方法进行梅毒代谢组学研究,发现三甲胺N -氧化物、L -精氨酸、溶菌素、甜菜碱和乙酰肉碱5种代谢物具有显著差异,并通过这些代谢产物的变化提示梅毒螺旋体影响宿主细胞的正常代谢活动。本研究基于LC-MS技术对ITP患儿和健康儿童血液样本进行非靶向代谢组学分析,对检测的原始数据进行滤噪、峰对齐、归一化、标准化等预处理后,采用主成分分析、正交-偏最小二乘判别分析、层次聚类分析等,发现ITP患儿与健康对照明显分离。并经HMDB, Metlin 等数据库进行代谢物结构鉴定,获取90种差异代谢物。然后根据Fold change值及ROC曲线结果选取了13种潜在关键差异代谢物,最终确定精氨基琥珀酸、腐胺、2-氧代精氨酸、5-羟色胺、间甲酚等5种内源性代谢物作为ITP的潜在生物标记物。5种生物标记物组成的生物标记物组对区分ITP患儿和健康儿童具有较高的准确性(ACU>0.9)。

5-羟色胺存在于所有的生物体中,在哺乳类动物中是一种抑制性神经递质,由L-色氨酸合成,主要参与色氨酸代谢。在调控毛细血管壁功能方面具有一定作用,也具有强收缩血管和收缩平滑肌的功能[11]。外周血的5-羟色胺大部分贮存在血小板中与,参与血小板止血或血栓形成的功能作用。因此,5-羟色胺含量与血小板的功能密切相关。5-羟色胺还具有免疫调节功能,与ITP 的发病机制可能存在共同通路。祁烁等[12]针对 ITP 模型小鼠血管活性物质调节作用的研究,显示ITP 模型组的5-羟色胺水平显著减低,与本研究结果一致。腐胺是一种最简单的多胺,由机体内氨基酸脱羧反应产生,大剂量即有毒性,被欧洲尿毒症毒素工作组确定为一种尿毒症毒素。腐胺已被证明在一些生态失调有关的疾病中起着重要作用。腐胺也存在于外周血血小板中,提示血小板溶解破坏有可能导致腐胺大量释放到外周血中,引起血中腐胺升高。精氨基琥珀酸是一种碱性氨基酸,在机体代谢途径中可作为精氨酸的前体。2-氧代精氨酸是精氨酸分解代谢的胍基化合物代谢物,在机体内大量蓄积可引起中枢神经系统损害。本研究中,精氨基琥珀酸、2-氧代精氨酸和精氨酸相对于健康对照都有显著性升高,提示ITP患儿体内精氨酸代谢增强,2-氧代精氨酸的生成增多可能对中枢神经系统存在损害。

临床上的自身免疫性疾病大多数病因不明,可能与遗传、免疫、激素和环境因素有关。ITP的发生也可能与药物和化学物质接触有关[13]。目前,研究最广泛的是由奎宁与血小板膜糖蛋白的特异性残基相互作用引起的药物性免疫性血小板减少症(DIT)[14]。1例病例报告[15]显示,1例患者被诊断为异烟肼诱导的免疫性血小板减少症,异烟肼停药后血小板计数恢复正常。本研究中,也筛选出一些具有差异性的外源性代谢物,如鲁比前列酮、异恶苯、L-组氨醇等。

本研究存在一些局限性。首先,研究对象数量相对较少。只有通过研究更多种族人群的更大规模试验,才能更好检验分析内源性或外源性代谢物与ITP之间的关联。其次,研究缺乏更多的临床相关指标,如治疗后相关患者数据信息。Zhang等[1]基于GC-MS对98例ITP患者和30例健康对照进行检测分析,识别出6个差异代谢物和5个富集通路,预测出慢性ITP患者对糖皮质激素耐药,揭示了ITP患者的代谢紊乱。LC-MS方法可能可以鉴定出更多的差异代谢物,从而更有可能鉴定出具有诊断和预后价值的代谢物,但需要更大的样本量来获得更准确的结果,而本研究仅纳入20例ITP患者,数量偏少。

综上所述,本研究基于LC-MS的代谢组学方法,发现ITP患儿与健康儿童存在较多的差异性代谢物,并筛选出5种内源性潜在关键差异代谢物,可能可以作为鉴别ITP患儿和健康儿童的临床实验室生物标记物。这些结果也有助于深入理解ITP的病理生理过程,并为ITP提供新的诊断和治疗策略。