五味子乙素通过Wnt/β-catenin 信号通路抑制膀胱癌增殖、迁移和侵袭

向玲宝，朱 奕，左 玲，刘宏伟

（1.广东医科大学附属医院泌尿外科研究室，广东 湛江 524001；2.广东医科大学附属第二医院中医科，广东 湛江 524003）

根据组织学类型进行分型，膀胱癌可分为鳞癌、尿路上皮癌和腺癌等［1］，其中90%以上为尿路上皮癌。膀胱尿路上皮癌中约75%为非肌层浸润性，25%为肌层浸润性或转移性［2］。2020 年全球癌症数据显示，膀胱癌占全球癌症诊断的3%，占男性癌症诊断的4.4%［3］。在我国，男性膀胱癌发病率为女性的3.8 倍，男性死亡率为女性的4 倍，是威胁我国居民健康的主要恶性肿瘤之一［4］。对于非肌层浸润性膀胱癌的治疗主要采用经尿道膀胱肿瘤电切术，术后辅以膀胱内化疗药物或卡介苗灌注，但术后具有较高的复发率。对于肌层浸润性膀胱癌，主要采用根治性膀胱切除、化疗、放疗等综合治疗措施，但术后2 年内有约50%的患者出现复发［5］。对于不能耐受手术或者转移性膀胱癌者可行静脉化疗或者免疫治疗，疗效仍不满意，并且静脉化疗会引起消化道反应、白细胞降低等不良反应，免疫治疗亦可出现免疫相关不良反应，如瘙痒、疲乏、恶心、无力、皮疹、发热等［6］。总体而言膀胱癌的治疗方案仍需要进一步优化，亟需探讨疗效满意且不良反应较低的潜在抗癌药物，因此将目光投向植物来源的中药单体，目前有大量研究发现植物来源的中药单体在肿瘤抑制方面发挥着重要的作用。

五味子作为中医临床常用药材，是木兰科五味子 属 植 物 的 干 燥 成 熟 果 实［7］。五 味 子 乙 素 （Schisandra B）是中药北五味子中一种活性单体，研究表明，五味子乙素表现出抗炎、抗氧化等广泛的药理作用［8］。近年来发现，五味子乙素能够发挥抗肿瘤作用，齐玲等［9］发现五味子乙素联合γ-分泌酶抑制剂可以抑制人胶质瘤增殖。彭朝阳等［10］发现五味子乙素可降低细胞侵袭能力、减少新生血管生成、诱导肝癌细胞凋亡。NASSER 等［11］发现五味子乙素可以有效抑制前列腺癌细胞的增殖，且具有浓度依赖性。然而，五味子乙素在膀胱癌的作用尚未阐明。本研究拟通过体外实验探讨五味子乙素对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响及分子机制，为膀胱治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人膀胱尿路上皮癌T24 和UM-UC-3 细胞株均从中国科学院细胞库（上海）购入；胎牛血清、DMEM 培养基及RPMI-1640 培养基购自Gibco 公司；五 味 子 乙 素（货 号200648-190901，CAS 号61281-37-6，检测纯度≥99%）购自江苏永健医药科技有限公司；Cell Counting Kit 试剂盒购自DOJINDO 公司；基质胶购买于Sigma 公司（货号E0282）；BCA 蛋白质定量检测试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；c-myc（货号10828-1-AP）、β-catenin 抗体（货号66009-1-Ig）和GAPDH（货号10494-1-AP）抗体购自Proteintech 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 T24 和UM-UC-3 细胞分别培养于含有10% 胎牛血清、1% 青霉素/链霉素的RPMI-1640 和DMEM 培 养 基，置 于37 °C 的 恒 温 培 养箱（含5% 浓度CO2）中培养。

1.2.2 五味子乙素对膀胱癌细胞半数抑制浓度的确定 将T24 和UM-UC-3 细胞消化重悬，按照每孔1 × 103个细胞的密度接种于96 孔板。24 h 后吸掉 培 养 基，分 别 加 入0.5、1、5、10、20、40、80、160 μmol/L 浓度的五味子乙素，每个浓度设3 个复孔，药物作用48 h，在每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h 后使用酶标仪测定在450 nm 波长下的OD值。以细胞存活率作为纵坐标，以log（药物浓度）作为横坐标，绘制浓度效应曲线，确定半数抑制浓度（IC50）。

1.2.3 CCK-8 法检测五味子乙素对细胞活力的影响 将T24 和UM-UC-3 细胞消化重悬并计数，将细胞接种于96 孔板中，每孔1 × 103个细胞。24 h后弃旧培养基，分别用不同浓度的五味子乙素溶液（0、20、40、80 μmol/L）处理，于加药后24、48、72 h向每孔加入10 μL CCK-8 溶液，孵育2 h 后使用酶标仪在450 nm 波长下测定样品的OD 值。将0 μmol/L 组的细胞活力定义为100%，细胞活力计算公式为：细胞活力=（实验组OD 值-培养基OD 值）/（对照组OD 值-培养基OD 值）×100%。

1.2.4 Transwell 迁移实验检测五味子乙素对细胞迁移能力的影响 取对数生长的T24 和UM-UC-3细胞，胰蛋白酶消化后离心，用不含血清的培养基重悬并计数。取600 μL 含20%血清浓度的完全培养基加入24 孔板下室，Transwell 小室内加入200 μL 细胞悬液，每个小室含8 × 104个细胞，置于37°C恒温培养箱中培养24 h。Transwell 小室采用多聚甲醛固定、结晶紫溶液染色各30 min。流动自来水冲洗小室侧壁多余结晶紫溶液，待其自然晾干后于显微镜下随机选取3 个视野进行拍照并统计穿膜细胞数目。

1.2.5 划痕实验检测五味子乙素对细胞划痕愈合率的影响 取对数生长期T24 和UM-UC-3 细胞，在6 孔板中接种细胞，每孔3×105个细胞。待细胞贴壁长满整个孔板后用200 μL 无菌移液枪头用力垂直划线，用PBS 清洗2 次。分别加入 0、20、40、80 μmol/L 浓度的五味子乙素溶液，用无血清培养基培养培养24 h。分别在细胞划痕后0 h 和24 h 拍照。划痕愈合率＝（0 h 划痕宽度—24 h 划痕宽度）/ 0 h划痕宽度×100%。

1.2.6 Transwell 侵袭实验检测五味子乙素对细胞侵袭能力的影响 按照基质胶∶培养基=1∶5 的比例在冰上进行稀释，小室内铺入50 μL 的基质胶稀释液并放置3～4 h 使之凝固。用胰酶消化对数生长期的T24 和UM-UC-3 细胞，离心、重悬细胞计数，在6 孔板每个孔中加入完全培养基2 mL（含2×105个细胞），24 h 后采用不同浓度的五味子乙素（0、20、40、80 μmol/L）处理，24 h 后消化细胞，离心后用无血清培养基重悬并计数。取200 μL 细胞悬液加入Transwell 小室内，取600 μL 完全培养基加入24 孔板内，放在37 °C 培养箱中孵育24 h。将Transwell小室用4%多聚甲醛液中固定、0.1%结晶紫染色，自来水流水冲洗小室外多余结晶紫染液，用棉签将小室内面的细胞擦掉，待其自然晾干后显微镜下观察并随机选取3 个不同视野拍照，统计细胞数目，计算平均值。

1.2.7 Western blot 检测五味子乙素对Wnt/β-catenin 通路相关蛋白表达的影响 在膀胱癌细胞中分别加入0、20、40、80 μmol/L 浓度的五味子乙素，48 h 后吸掉培养基，用PBS 清洗后用RIPA 裂解液裂解30 min，细胞刮刀刮取细胞收集至离心管，离心后提取总蛋白。蛋白浓度采用BCA 法进行测定，配制SDS-PAGE 凝胶，将30 μg 蛋白质样品加入至每个孔中，恒压电泳2 h。恒流电转2 h 将蛋白质转移到PVDF 膜，然后在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST 溶液浸泡PVDF 膜1 h，分别将一抗β-catenin（1∶5 000）、c-myc（1∶2 000）和GAPDH（1∶10 000）加入到相应的PVDF 膜上，置于4°C 冰箱内过夜。次日用TBST 溶液清洗PVDF 膜3 次，室温下孵育相应的二抗1 h，TBST 清洗3 次，每次10min，然后利用化学发光法进行曝光并采集图片。

1.3 统计学方法

采 用Graphpad Prism7.0、Image J 以 及SPSS 20.0 软件进行分析，计量资料采用均数±标准差表示，多组间的比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 五味子乙素对膀胱癌细胞半数抑制浓度的确定

分别用0.5、1、5、10、20、40、80、160 μmol/L 浓度的五味子乙素处理膀胱癌T24 和UM-UC-3 细胞48 h，浓度效应曲线显示40 μmol/L 的浓度最接近半数抑制浓度（图1），后续实验采用20、40、80 μmol/L 三个浓度。

图1 五味子乙素对膀胱癌T24 和UM-UC-3 细胞作用浓度的确定Fig 1 Determination of the concentration of Schisandra B on bladder cancer T24 and UM-UC-3 cells

2.2 五味子乙素对膀胱癌细胞活力的影响

与0 μmol/L 浓度组比较，五味子乙素干预T24和UM-UC-3 细胞24、48、72 h 后细胞活力下降，随着五味子乙素浓度和孵育时间的增加，T24 和UM-UC-3 细胞的活力逐渐下降，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明五味子乙素明显抑制T24 和UM-UC-3 细胞的增殖，呈时间和剂量依赖性。结果见图2、表1 和表2。

表1 不同浓度五味子乙素作用不同时间对T24 细胞活力的影响（n=3，±s）Tab 1 Effects of different concentrations of Schisandra B on the viability of T24 cells at different time points （n=3，±s）

表1 不同浓度五味子乙素作用不同时间对T24 细胞活力的影响（n=3，±s）Tab 1 Effects of different concentrations of Schisandra B on the viability of T24 cells at different time points （n=3，±s）

药物浓度0 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L 80 μmol/L F P 24 h 100 92.33±4.16 76.33±4.58 53.03±5.29 83.926＜0.001 48 h 100 80.67±4.04 60.67±4.51 39.67±5.03 139.362＜0.001 72 h 100 72.33±4.93 46.33±5.51 26.67±3.51 229.652＜0.001 15.661 41.354 23.761 0.004＜0.001 0.001 FP

表2 不同浓度五味子乙素作用不同时间对UM-UC-3 细胞活力的影响（n=3，±s）Tab 2 Effects of different concentrations of Schisandra B on the viability of UM-UC-3 cells at different time points（n=3，±s）

表2 不同浓度五味子乙素作用不同时间对UM-UC-3 细胞活力的影响（n=3，±s）Tab 2 Effects of different concentrations of Schisandra B on the viability of UM-UC-3 cells at different time points（n=3，±s）

药物浓度0 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L 80 μmol/L F P 24 h 100 89.33±3.51 74.00±5.29 60.00±3.00 74.622＜0.001 48 h 100 77.00±4.36 57.33±4.73 39.33±3.51 152.039＜0.001 72 h 100 61.00±6.56 46.33±5.03 30.67±4.51 119.424＜0.001 24.435 23.079 49.056 0.001 0.002＜0.001 FP

图2 五味子乙素对膀胱癌T24 和UM-UC-3 细胞活力的影响Fig 2 Effects of Schisandra B on the viability of bladder cancer T24 and UM-UC-3 cells

2.3 五味子乙素对膀胱癌细胞迁移能力的影响

与0 μmol/L 浓度组比较，不同浓度的五味子乙素 作 用T24 和UM-UC-3 细 胞24 h，Transwell 迁 移实验表明随着五味子乙素浓度增加，T24 和UM-UC-3 细胞迁移数目逐渐降低，差异有统计学意 义（P＜0.05）。划 痕 实 验 结 果 显 示，T24 和UM-UC-3 细胞划痕愈合率随着五味子乙素浓度的增加而呈现递减趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图3、表3。

表3 五味子乙素对T24 和UM-UC-3 细胞迁移的影响（n=3，±s）Tab 3 Effects of Schisandra B on migration of T24 and UM-UC-3 cells（n=3，±s）

表3 五味子乙素对T24 和UM-UC-3 细胞迁移的影响（n=3，±s）Tab 3 Effects of Schisandra B on migration of T24 and UM-UC-3 cells（n=3，±s）

注：与0 μmol/L 组比较，*P＜0.05；与20 μmol/L 组比较，#P＜0.05；与40 μmol/L 组比较，ΔP＜0.05。

药物浓度T24 UM-UC-3迁移细胞数（个）划痕愈合率（%）迁移细胞数（个）划痕愈合率（%）359.30±22.74 284.00±6.56*164.70±5.51*#143.00±11.36*#Δ 173.638＜0.001 0 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L 80 μmol/L FP 73.79±4.83 45.22±2.49*30.31±2.84*#18.95±1.36*#Δ 171.234＜0.001 436.70±14.05 160.30±8.02*94.67±4.51*#72.00±3.00*#Δ 1164.274＜0.001 63.99±4.15 49.01±2.27*41.22±2.80*#31.94±1.76*#Δ 66.351＜0.001

图3 五味子乙素对膀胱癌T24 和UM-UC-3 细胞迁移的影响Fig 3 Effects of Schisandra B on migration ability of bladder cancer T24 and UM-UC-3 cells

2.4 五味子乙素对膀胱癌细胞侵袭能力的影响

Transwell 侵 袭 实 验 数 据 显 示，与0 μmol/L 浓度组比较，T24 和UM-UC-3 细胞的侵袭能力随着五味子乙素浓度增大而降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果见图4、表4。

图4 五味子乙素对膀胱癌T24 和UM-UC-3 细胞侵袭能力的影响Fig 4 Effects of Schisandra B on the invasion ability of bladder cancer T24 and UM-UC-3 cells

表4 五味子乙素对T24和UM-UC-3细胞侵袭的影响（n=3，±s）Tab 4 Effects of Schisandra B on the invasion of T24 and UM-UC-3 cells （n=3，±s）

表4 五味子乙素对T24和UM-UC-3细胞侵袭的影响（n=3，±s）Tab 4 Effects of Schisandra B on the invasion of T24 and UM-UC-3 cells （n=3，±s）

注：*与0 μmol/L 组比较，P＜0.05；#与20 μmol/L 组比较，P＜0.05；Δ与40 μmol/L 组比较，P＜0.05

UM-UC-3 侵袭细胞数（个）药物浓度T24 侵袭细胞数（个）414.00±13.53 285.70±14.29*211.00±8.54*#150.00±4.58*#Δ 322.180＜0.001 0 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L 80 μmol/L FP 298.70±9.51 199.30±6.03*162.70±7.51*#94.33±6.03*#Δ 397.359＜0.001

2.5 五味子乙素对Wnt/β-catenin 信号通路相关蛋白的影响

Western blot 结 果 显 示，与0 μmol/L 浓 度 组 比较，随着五味子乙素浓度增加，β-catenin 和c-myc 蛋白表达呈递减趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。结果见图5、表5。

表5 五味子乙素对T24 和UM-UC-3 细胞β-catenin 和c-myc 蛋白的影响（n=3，±s）Tab 5 Effects of Schisandra B on the expression of β-catenin and c-myc proteins in T24 and UM-UC-3 cells （n=3，±s）

表5 五味子乙素对T24 和UM-UC-3 细胞β-catenin 和c-myc 蛋白的影响（n=3，±s）Tab 5 Effects of Schisandra B on the expression of β-catenin and c-myc proteins in T24 and UM-UC-3 cells （n=3，±s）

注：与0 μmol/L 组比较，*P＜0.05；与20 μmol/L 组比较，#P＜0.05；与40 μmol/L 组比较，ΔP＜0.05。

药物浓度T24 UM-UC-3 c-myc β-catenin c-myc β-catenin 0 μmol/L 20 μmol/L 40 μmol/L 80 μmol/L 1.00±0.03 0.81±0.02*0.64±0.03*#0.43±0.02*#Δ 286.949＜0.001 FP 1.00±0.04 0.65±0.03*0.45±0.01*#0.35±0.04*#Δ 223.680＜0.001 1.00±0.07 0.73±0.03*0.55±0.03*#0.47±0.01*#Δ 104.349＜0.001 1.00±0.06 0.75±0.00*0.53±0.02*#0.45±0.01*#Δ 186.971＜0.001

图5 五味子乙素处理后T24 和UM-UC-3 细胞内β-catenin 和c-myc 蛋白变化Fig 5 protein changes of β-catenin and c-myc in T24 and UM-UC-3 cells after treatment with Schisandra B

3 讨论

随着我国人口结构老龄化，膀胱癌的发生率和死亡率逐年增加［12］。膀胱癌是起源于尿路上皮的异质性肿瘤，荧光或窄谱光引导下经尿道膀胱肿瘤切除术能同时兼顾诊断和治疗非肌层浸润性膀胱癌［5］，采用根治性膀胱切除术并联合盆腔淋巴结清扫治疗肌层浸润性膀胱癌，能有效降低肿瘤局部复发或远处转移的几率，改善患者预后［13］。但由于手术风险高、创伤大，以及术后生活质量差等原因，部分患者拒绝行根治性膀胱切除术，需要寻求新的治疗方法。

此前有研究表明五味子乙素具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，赵炜等［14］发现五味子乙素具有较好的抗乳腺癌作用，张卉等［15］发现五味子乙素可以有效抑制甲状腺癌的增殖，Jiang 等［16］发现五味子乙素可以抑制胶质瘤转移，然而在膀胱癌中的作用尚不清楚。本研究CCK-8 实验提示五味子乙素呈时间和剂量依赖性抑制膀胱癌细胞的增殖。Transwell 迁移和划痕实验的结果均显示五味子乙素能够抑制膀胱癌细胞的迁移能力，随着五味子乙素浓度的增加，膀胱癌细胞在处理24 h 后的迁移距离和细胞数目受到更大程度的抑制。Transwell 侵袭实验结果表明细胞的穿膜比例与五味子乙素的浓度呈现负相关关系，五味子乙素浓度越高，穿过基膜的细胞比例越少，表明五味子乙素能够抑制膀胱癌细胞的侵袭能力。此外，有研究指出五味子乙素通过Wnt/β-catenin 信号通路途径抑制人胰腺癌细胞增殖和侵袭［17］，并且也通过介导该信号通路诱导胰腺癌细胞及乳腺癌细胞的凋亡［17，18］。Wnt/β-catenin信号通路异常激活与恶性肿瘤的发生、不良预后等密切相关，当胞质中β-catenin 分子累积到一定程度便可转移至细胞核内。在细胞核中β-catenin 与LEF/TCF 转录因子家族结合进而启动下游c-myc等原癌基因的转录而促进细胞的增殖、迁移与侵袭［19］。C-myc 是 原 癌 基 因MYC 编 码 的 转 录 因 子，是Wnt/β-catenin 信号通路途径的核心分子之一［20］，其在膀胱癌中过表达并参与调控膀胱癌细胞的增殖与侵袭［21］。本团队前期研究发现Wnt/β-catenin信号通路激活促进膀胱癌的增殖和侵袭［22］。据此本研究探索五味子乙素是否通过Wnt/β-catenin 信号通路途径抑制膀胱癌的增殖、迁移和侵袭，本研究采用western-blot 检测了Wnt/β-catenin 信号通路中的关键分子β-catenin 以及下游靶基因c-myc 蛋白的表达，结果表明随着五味子乙素浓度的增加，β-catenin 和c-myc 蛋白的相对表达量呈现递减趋势，说明五味子乙素通过降低β-catenin 和c-myc 蛋白的表达抑制Wnt/β-catenin 信号通路的激活，从而抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，本研究表明五味子乙素能够抑制膀胱癌细胞的的增殖、迁移、侵袭能力。此外还发现五味子乙素能降低β-catenin 和c-myc 蛋白的表达，说明其通过抑制Wnt/β-catenin 信号通路的激活而发挥膀胱癌抑癌作用，其深入机制有待进一步探讨。