跨膜蛋白41B 在肝细胞肝癌组织中的表达及其对患者预后的影响

辜国军，秦易，胡萌宇

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第四大恶性肿瘤，同时，也是全球第三大癌症死亡原因［1］。HCC 发病隐匿，早期较难被发觉，多数患者就诊时已为中晚期，因此，死亡率一直居高不下［2］。近年来，针对HCC 的治疗手段越来越多，如射频消融术、经肝动脉化疗栓塞及靶向药物治疗等，均取得了较好的治疗效果，但仍有部分HCC 患者术后复发、转移或死亡，预后较差［3］，因此，早期了解预后情况并及时给予有效的治疗具有重要意义。CT 或MRI 等影像学检查可明显观察到HCC 病灶大小和边缘强化情况，在评估肿瘤病灶控制方面有较高的价值，但对于评估预后的价值较低。因此，急需探寻价值较高的指标用于HCC 预后评估。

自噬在HCC 发展过程中发挥着重要作用，其可调节癌细胞的凋亡、耐药等［4］。跨膜蛋白41B（TMEM41B）是一种细胞自噬调节蛋白，在自噬小体的形成过程中起着关键作用［5-8］，其与泡膜蛋白1 在结构和功能上具有相似之处［9］。泡膜蛋白1 可通过调节癌细胞的转移和增殖影响HCC 预后［10］。基于上述研究，有理由认为TMEM41B 与HCC 有关，是评估HCC 预后的潜在生物标志物。目前，少有研究分析TMEM41B 与HCC 预后的关系，本研究主要分析TMEM41B 在HCC 组织中的表达及其对患者预后的影响，以期为HCC 的预后评估提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2016 年3 月至2018 年3 月在眉山市第二人民医院就诊的164 例HCC 患者作为研究对象，男性106 例，女性58 例；年龄48～70 岁［（62.18 ±4.66）岁］；乙肝表面抗原（HBsAg）阳性135 例；Child-Pugh A 级123 例，B 级41 例；肿瘤直径＞5 cm 79 例；肿瘤单发62 例，多发102 例；甲胎蛋白（AFP）＞400 μg/L 96 例；血管侵犯79 例；肿瘤分期Ⅰ期15 例，Ⅱ期70 例，Ⅲ期79 例。参照《原发性肝癌诊疗规范》［11］诊断HCC。纳入标准：（1）病理活检确诊为HCC；（2）临床资料完整。排除标准：（1）随访失联；（2）合并其他恶性肿瘤；（3）肝、肾功能严重异常；（4）有自身免疫性疾病史或血液系统疾病史等；（5）获取HCC 组织前接受放、化疗、生物治疗或靶向治疗等。本研究所有受试者均知情同意，签署了知情同意书。本研究符合《赫尔辛基宣言》，经眉山市第二人民医院医学伦理委员会批准［伦理批号：2022 年审（05）号］。

1.2 TMEM41B 表达量检测

用蛋白质免疫印迹法［12］检测TMEM41B 表达量。取冻存的穿刺或手术获取的HCC 组织和癌旁组织，解冻后剪碎，用TL2020 型组织研磨仪［鼎昊源（天津）生物科技有限公司］研磨，获取组织匀浆。用RIPA 裂解液裂解组织细胞，4 ℃下4 000 r/min离心15 min，离心半径为8 cm，提取离心后上清液。BCA 法对蛋白进行定量。80 V 凝胶电泳15 min，然后加压至120 V，直至溴酚蓝跑出胶面；300 mA 60 min 进行转膜；5% 脱脂牛奶摇床孵育1 h；滴加兔抗人TMEM41B 多克隆抗体（台湾亚诺法生技股份有限公司，批号：PAB20785），4 ℃下孵育过夜；滴加山羊抗兔二抗（台湾亚诺法生技股份有限公司，批号：PAB10828），摇床孵育1 h；ECL 发光液显影。用Image J 1.8.0 软件分析凝胶图像。

1.3 随访

于受试者出院后1 个月随访，之后每3～6 个月随访1 次，共随访3 年，末次随访时间为2021 年4 月，随访终点为至随访结束或死亡。随访6～36 个月，111 例HCC 患者存活（生存组），53 例死亡（死亡组）。

1.4 统计学处理

用SPSS 25.0 软件进行统计分析。正态分布的计量资料以±s表示，组内比较采用配对样本t检验，2 组间比较采用独立样本t检验。多组间比较采用F检验，组间两两比较采用SNK-q检验。计数资料以频数和%表示，组间比较采用χ2检验。用受试者工作特征（ROC）曲线评价TMEM41B 诊断HCC 预后的效能。用Cox 回归分析HCC 预后的风险因素。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TMEM41B 在HCC 组织和癌旁组织中的表达

HCC 组织中TMEM41B 表达量0.36 ± 0.06 高于癌旁组织0.21 ± 0.05，差异有统计学意义（t=25.087，P＜0.001）。见图1。

图1 TMEM41B 在HCC 组织和癌旁组织中的表达

2.2 TMEM41B 与HCC 患者的一般资料和临床病理参数的关系

不同年龄、性别、HBsAg、Child-Pugh 分级、肿瘤数目和AFP 的HCC 患者的TMEM41B 相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。肿瘤直径＞5 cm 的HCC 患者TMEM41B 相对表达量高于肿瘤直径≤5 cm 的HCC 患者，血管侵犯的HCC 患者TMEM41B 相对表达量高于未侵犯血管的HCC 患者，肿瘤分期Ⅲa 期的HCC 患者TMEM41B 相对表达量高于Ⅰ期的HCC 患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 TMEM41B 与HCC 患者的一般资料和临床病理参数的关系

2.3 TMEM41B 与HCC 预后的关系

生存组的TMEM41B 相对表达量（0.34 ± 0.05）低于死亡组（0.40 ± 0.07），差异有统计学意义（t=4.534，P＜0.001）。TMEM41B 诊 断HCC 预 后 的ROC 曲线下面积、最佳截断点、灵敏度和特异度分别为0.716（95%CI：0.631～0.801）、0.34、75.47%和60.36%。见图2。

图2 TMEM41B 诊断HCC 预后的ROC 曲线

2.4 HCC 预后的Cox 回归分析

将HCC 预后作为因变量，将年龄、性别、HBsAg、Child-Pugh 分级、肿瘤直径、肿瘤数目、AFP、肿瘤分期和TMEM41B（以TMEM41B 诊断HCC 预后的ROC 曲线最佳截断点为界值将其转换为二分类变量）作为自变量，分别纳入Cox 回归分析，结果显示Child-Pugh 分级、肿瘤直径、AFP、肿瘤分期和TMEM41B 与HCC 预后有关（P＜0.05）。将HCC 预后作为因变量，将Child-Pugh 分级、肿瘤直径、AFP、肿瘤分期和TMEM41B 作为自变量，一并纳入Cox回归分析，结果显示Child-Pugh B 级、肿瘤直径＞5 cm、肿瘤分期和TMEM41B＞0.34 是HCC 预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表3、4。

表3 HCC 预后风险因素的Cox 多因素分析结果

表3 HCC 预后风险因素的Cox 单因素分析结果

3 讨论

自噬是一种真核细胞特有的代谢方式，其可清除胞质内受损的细胞器及活性氧物质等，用于维持细胞内稳态和DNA 的稳定［13］。正常条件下，细胞的自噬活动处于较低水平，当受到细胞因子、缺氧、缺营养物质等刺激时，自噬增强［14］。HCC 细胞自噬与其凋亡、治疗敏感度密切相关［15-16］。TMEM41B 表达降低可抑制自噬体的生物合成，从而干扰细胞自噬［5-8］。目前，TMEM41B 已被报道与骨肉瘤［17］和肺癌［18］的发生发展相关，但关于其与HCC 的关系鲜有研究报道。本研究主要分析TMEM41B 在HCC 组织中的表达及对患者预后的影响，以期为HCC 的预后评估提供参考依据。

本研究结果显示HCC 组织中TMEM41B 相对表达量高于癌旁组织，该结果提示TMEM41B 与HCC发病和进展有关，是HCC 预后的潜在生物标志物。本研究分析不同HCC 病理参数的TMEM41B 相对表达量，结果显示肿瘤直径＞5 cm 的HCC 患者TMEM41B 相对表达量高于肿瘤直径≤5 cm 的HCC患者。该结果提示TMEM14B 可能通过调控肿瘤大小影响HCC 预后。推测其原因是HCC 细胞繁殖迅速，需要大量物质供能。HCC 细胞中TMEM41B 的表达上调可促进细胞自噬，进而为其增殖提供能量，故TMEM41B 表达量越高，肿瘤病灶可能越大。血管侵犯的HCC 患者TMEM41B 相对表达量高于未侵犯血管的HCC 患者，该结果提示TMEM14B 可能通过促进血管侵犯影响HCC 预后。推测其原因是TMEM41B 表达上调可促进HCC 细胞自噬，从而为其血管侵犯供能，故存在血管侵犯的患者，其癌组织中TMEM41B 表达上调。肿瘤分期Ⅲa 期的HCC患者TMEM41B 相对表达量高于Ⅰ期的HCC 患者，推测其原因是肿瘤病灶和血管侵犯与肿瘤分期密切相关，TMEM41B 表达上调可增加肿瘤病灶大小并促进血管侵犯，故肿瘤分期Ⅲa 期的TMEM41B 相对表达量更高。

本研究中164 例HCC 患者3 年生存率为67.68%，与王鹤等［19］结果（66.7%）接近。本研究比较了生存组和死亡组的TMEM41B 相对表达量，结果显示生存组的TMEM41B 相对表达量低于死亡组，该结果证实TMEM41B 与HCC 预后有关，或可成为评价HCC 预后的生物标志物。本研究进一步构建了TMEM41B 诊断HCC 预后的ROC 曲线，结果显示其诊断HCC 预后的ROC 曲线下面积、灵敏度和特异度分别为0.716、75.47%和60.36%，该结果提示TMEM41B 对HCC 预后评价有一定价值，尚可辅助用于临床医师评估HCC 预后。

本研究用Cox 回归分析了HCC 预后的风险因素，结果显示TMEM41B＞0.34 是HCC 预后的独立危险因素，推测其原因可能有以下2 点：（1）TMEM41B 通过调节HCC 细胞自噬使其免于凋亡；（2）TMEM41B 通过调节HCC 细胞自噬使其避免化疗药物、靶向药物诱发的损伤，从而影响HCC 预后。HCC 组织中TMEM41B 表达量可反映HCC 细胞的自噬程度，进而反映HCC 预后，其病理生理机制仍有待开展基础研究进一步证实。此外，本研究结果还显示Child-Pugh B 级、肿瘤直径＞5 cm 和肿瘤分期高是HCC 预后的独立危险因素，与既往报道［20-21］结果一致。

综上所述，HCC 组织中TMEM41B 表达与肿瘤直径、血管侵犯和肿瘤分期有关。HCC 组织中TMEM41B 表达量高提示HCC 预后不良。本研究尚存在一定不足，一是样本量偏小，样本选择上可能存在一定选择偏倚，还需开展大样本、多中心研究进一步分析TMEM41B 与HCC 预后的关系；二是未开展基础研究分析TMEM41B 参与HCC 发病和进展的病理生理机制，下一步将针对上述不足进行补充，以充实本研究结论。