血清miR-23a、ESM-1、CA-199在结直肠癌患者中的表达及临床意义

陈 杰,吴 勇

重庆市丰都县人民医院检验科,重庆 408200

结直肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤之一,是全球第三大常见肿瘤,也是第二大常见肿瘤死因[1]。结直肠癌患者起病隐匿,早期无明显症状,加上缺乏早期有效的检测手段,导致大多数患者就诊时已处于晚期,5年生存率不足12%[2]。因此,寻找有效的生物标志物对结直肠癌患者的早期诊断、病情评估、生存率提高具有重要意义。微小核糖核酸-23a(miR-23a)是一种促癌基因,可在结直肠癌中异常表达[3],内皮细胞特异性分子-1(ESM-1)是肿瘤内皮组织血管侵袭的生物标志物[4],糖类抗原-199(CA-199)是最常用的消化道恶性肿瘤的早期诊断指标[5]。目前临床上对结直肠癌的针对性检测指标较少,主要以癌胚抗原、CA199为主,均缺乏一定特异性。本研究主要探讨血清miR-23a、ESM-1、CA-199在结直肠癌患者中的表达差异,首次利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析其诊断价值,并分析其与患者临床病理特征的关系,以期为结直肠癌患者的早期诊断及病情评估提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性选取2020年1-12月本院收治的结直肠癌患者128例作为癌症组,其中男70例、女58例,平均年龄(62.6±9.5)岁。纳入标准：(1)初次确诊,病历完整,且符合《中国结直肠癌诊疗规范(2020版)》[6]的诊疗标准;(2)均经术后病理切片检查证实为结直肠癌。排除标准：(1)重要脏器功能障碍;(2)合并其他恶性肿瘤;(3)合并肠梗阻、肠穿孔等其他肠道疾病;(4)妊娠期或哺乳期妇女。选取同期本院收治的结直肠腺瘤患者100例作为腺瘤组,其中男55例、女45例,平均年龄(62.0±9.2)岁,均经术后病理切片结果确认。术后定期随访,每月复查1次,通过增强CT或磁共振成像观察是否出现淋巴结转移及远处转移：发生淋巴结节转移38例,发生远处转移28例,其中肝转移15例,约占53.6%;肺转移8例,约占28.6%;盆腔转移4例,约占14.3%;广泛性转移1例,约占3.5%。另选取同期本院100例体检健康者作为对照组,其中男55例、女45例,平均年龄(61.9±10.0)岁。3组研究对象的一般资料比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准同意,符合伦理学标准。

1.2方法 采集所有入组研究对象空腹静脉血3 mL,负压注入无添加剂真空干燥管,颠倒混匀数次。静置30 min后以3 000 r/min离心10 min,取上清液保存于-80 ℃的超低温冰箱中待测。所有操作严格按照试剂盒说明书进行,阴阳对照、室内质控均在控。

1.2.1miR-23a的检测 miR-23a水平采用实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)进行检测,仪器为ABI7500型PCR仪。吸取200 μL保存的上清液,加入1 mL Trizol裂解液,在室温下裂解5 min。再加入200 μL氯仿,静置15 min后以12 000 r/min的转速在4 ℃条件下离心15 min,吸取上清液后加入等体积异丙醇,过夜沉淀12 h。再次离心后弃去上清液用75%乙醇洗涤沉淀物,再以8 000 r/min的转速在4 ℃条件下离心5 min,重复操作2次后晾干沉淀物。用适量的75%乙醇处理水溶解的RNA。反转录试剂盒由TAKARA公司提供,反转录后得到模板单链的cDNA。miR-23a正向引物为5′-CCGCCGGGATCCACGGCGG-3′,反向引物为5′-CCGCCGAAGCTTCAGAGCTCAGGGTCGGTTGG-3′。

采用U6作为内参,U6的正向引物是5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,反向引物是5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。配制10 μL的体系,反应条件：90 ℃ 30 s,60 ℃ 30 min,94 ℃ 1 min,连续40个循环,再72 ℃ 1 min后收集荧光信号,测量3次。

1.2.2ESM-1的检测 ESM-1水平采用酶联免疫吸附试验进行检测,试剂盒由上海酶联生物科技有限公司提供,酶标仪由美国公司BioTek公司生产。

1.2.3CA-199的检测 CA-199水平采用贝克曼DXI-800全自动免疫分析仪及其配套试剂进行检测。

2 结 果

2.13组研究对象血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平比较 癌症组患者的miR-23a、ESM-1、CA-199水平明显高于腺瘤组和对照组,腺瘤组明显高于对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组研究对象血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平比较

2.2血清miR-23a、ESM-1、CA-199对结直肠癌的诊断价值 ROC曲线分析结果显示,血清miR-23a、ESM-1、CA-199联合诊断结直肠癌的曲线下面积(AUC)为0.900,灵敏度和特异度分别为84.2%、90.8%,均高于血清miR-23a、ESM-1、CA-199单项检测。见表2、图1。

图1 miR-23a、ESM-1、CA-199单项及联合诊断结直肠癌的ROC曲线

表2 血清miR-23a、ESM-1、CA-199单项及联合诊断结直肠癌的效能

2.3不同临床病理特征结直肠癌患者中血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平比较 血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平在TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移及有远处转移的患者中明显高于Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移及无远处转移的患者,差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同临床病理特征结直肠癌患者中血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平比较

2.4血清miR-23a、ESM-1、CA-199与临床病理特征的相关性分析 Spearman相关分析结果显示,血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平与TNM分期、淋巴结转移、远处转移呈正相关(P<0.05)。见表4。

表4 血清miR-23a、ESM-1、CA-199与临床病理特征的相关性分析

3 讨 论

结直肠癌是全球第三大常见癌症,每年新增病例超过130万,而死亡病例则超过了60万,已严重威胁人类生命健康[7]。早期结直肠癌无明显症状,只有约5%的早期患者可得到确诊,大多数患者就诊时已处于中晚期[8]。结直肠镜是结直肠癌早期诊断的重要方式,但因其需要彻底的肠道准备,且为侵入性操作,导致患者依从性较低。粪便潜血试验是目前临床上比较常用的筛查手段,但灵敏度和特异度均存在一定不足,易漏诊误诊。血清学检查具有无创、安全、简便等特点而广泛应用于肿瘤的筛查和监测。

微小核糖核酸是一种小分子的单链非编码RNA,一般由22个碱基组成,在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用,包括调节肿瘤细胞增殖、血管生成、侵袭及转移等,miR-23a在结直肠癌患者中异常表达[9-10]。ESM-1属于硫酸皮肤素蛋白聚糖,大部分由激活的内皮细胞分泌,内皮功能正常时含量正常,当新生血管形成或内皮细胞受到损伤时其合成就会增加[11]。ESM-1表达于肿瘤内皮细胞中,可加快细胞增殖,加速血管产生,诱发免疫抑制反应等促进肿瘤发生发展[12]。本研究结果显示,ESM-1水平在结直肠癌患者中明显升高。CA-199是一种糖类抗原,在血清中以唾液黏蛋白的形式存在,在消化系统的正常组织中可检测到,水平升高时往往预示疾病恶化,可用于结直肠癌的监测[13]。本研究结果显示,结直肠癌患者中血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平明显升高。首次利用ROC曲线对3个指标对结直肠癌的诊断效能进行分析,结果发现3个指标联合检测的AUC为0.900,优于3个指标单项检测,提示联合检测对结直肠癌具有较高的诊断价值,该结果对临床诊断工作具有一定指导意义。

根据不同临床病理特征对结直肠癌患者进行分组,结果发现,TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴结转移及有远处转移患者的血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平明显高于高于Ⅰ+Ⅱ期、无淋巴结转移及无远处转移患者(P<0.05),表明上述3个指标与肿瘤负荷有关,肿瘤负荷越大,肿瘤细胞释放的血清miR-23a、ESM-1、CA-199越多,故其在结直肠癌的发生和发展中发挥重要作用。TNM分期能反映肿瘤的恶性程度,肿瘤标志物的水平往往与TNM分期进展相关[14]。淋巴结转移是结直肠癌转移的主要途径之一,是影响患者预后的重要因素[15]。侵袭性转移是恶性肿瘤的重要生物学特征,发生远处转移的肿瘤患者一般已进展至中晚期,病情严重,预后也较差[16]。本研究Spearman相关分析结果显示,血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平与TNM分期、淋巴结转移、远处转移呈正相关(P<0.05)。

综上所述,血清miR-23a、ESM-1、CA-199水平在结直肠癌患者中明显升高,联合检测有助于患者的早期诊断及病情评估。本研究也存在一定不足之处,未对患者进行长期跟踪回访,对其长期预后效果尚不明确,这也将是未来的研究重点。