肺泡灌洗液二代测序在儿童社区获得性肺炎诊疗中的应用价值

宁 宁,陈 强,王 双,江超花,丁国际

1.江西省九江市妇幼保健院儿童呼吸科,江西九江332000;2.江西省儿童医院呼吸内科,江西南昌 330000

儿童社区获得性肺炎(CAP)是儿科的常见病和多发病,也是我国目前5岁以下儿童死亡的主要原因之一,具有起病急、进展快的特点,通常伴有发热、咳嗽、呼吸增快、肺部湿性啰音等表现,并有肺部影像学的异常改变[1]。CAP病原体种类复杂多样,包含病毒、细菌、真菌、非典型病原体等。感染方式可以为单一病原体感染或混合感染,混合感染在肺炎病原体感染中占重要比例[2]。如何准确、快速、全面识别病原体,予以精准、合理用药,以减少抗生素的不合理使用,降低病死率和后遗症的发生,降低医疗费用[1],已成为CAP诊治中的难题。传统的病原学诊断方法如涂片镜检、培养分离、免疫学检测等存在假阳性,阳性率低,对特殊病原体培养耗时长,特异度不高,步骤复杂、操作要求高,已经远远不能满足临床工作的需要[3-4]。二代测序(NGS)无须经过实验室进行微生物培养,直接对标本中的DNA或RNA进行高通量测序,能够客观、快速地一次性检测出标本中的多种病原微生物,为急危重症和疑难感染性疾病提供了诊断依据,具有准确性更强、检测时效更好、无偏倚、全面覆盖及产出巨大等特点,在临床诊疗方面的应用越来越广泛[5-7]。本研究拟通过NGS检测肺泡灌洗液,对比传统病原微生物检测方法,评估NGS的检验效能及临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年6月至2022年7月九江市妇幼保健院儿童呼吸科收治的116例CAP并行纤维支气管镜肺泡灌洗的患儿为研究对象,其中男60例,女56例;年龄1～14岁,平均(6.84±2.54)岁。纳入标准：(1)符合《儿童社区获得性肺炎诊疗规范(2019版)》[1]诊断标准。①有发热、咳嗽或喘息、呼吸增快等症状;②肺部可闻及固定的湿性啰音,部分支原体肺炎患儿可无啰音;③胸部X线片或胸部CT提示存在大片状实变影,或存在肺不张,或合并胸腔积液。(2)符合《中国儿科可弯曲支气管镜术指南(2018年版)》[8]适应证第9条胸部影像学异常。排除标准：(1)合并其他严重心、肝、肾等疾病;(2)影像学检查不支持支气管肺炎;(3)存在纤维支气管镜检查相对禁忌证;(4)家属拒绝行纤维支气管镜检查;(5)家属拒绝肺泡灌洗液外送第三方检测机构行NGS检测。本研究经医院伦理委员会批准(LLSC-2022-030)。所有患儿家属知情同意并签署知情同意书。

1.2方法 所有入组患儿均予以综合性治疗,经验性抗感染、补液退热、止咳祛痰及雾化吸入等对症治疗。完善传统的病原学微生物检测及血生化、炎症指标等相关检查。征得患儿家属同意后完善纤维支气管镜术前检查,行纤维支气管镜肺泡灌洗,留取肺泡灌洗液,外送第三方检测机构行NGS检测。

1.2.1传统病原微生物检测 包括血或痰培养、肺泡灌洗液培养、呼吸道病毒七项检测、肺炎支原体、肺炎衣原体、结核抗体等检测。其中呼吸道病毒七项检测采用免疫荧光法,七项呼吸道病毒检测试剂盒购自海德诊断有限公司;肺炎支原体抗体检测采用被动凝集法,赛乐迪亚-麦可Ⅱ试剂盒购自富士瑞必欧株式会社;肺炎衣原体抗体检测采用酶联免疫吸附试验,肺炎衣原体IgM抗体检测试剂盒购自丽珠试剂股份有限公司;结核抗体检测采用胶体金法,结核分枝杆菌IgG抗体检测试剂盒购自上海奥普生物医药股份有限公司。血或痰培养均为细菌培养法。上述检测严格按照试剂盒操作说明书进行。呼吸道病毒七项检测阳性提示存在相应病毒感染的可能性大,结合临床情况加以分析。肺炎支原体IgM≥1∶160提示存在近期或急性感染,恢复期和急性期抗体滴度呈4倍或4倍以上升高或降低,提示肺炎支原体感染;滴度<1∶160或阴性需结合临床表现加以分析。肺炎衣原体、结核抗体阳性需结合临床表现判断是否存在其他感染。血培养、痰培养及灌洗液培养阳性需结合相关菌落及临床表现判断感染菌、定植菌或污染菌。

1.2.2NGS检测 征得家属同意后将肺泡灌洗液外送第三方检测机构(广州金域医学检验集团股份有限公司)行NGS检测,采用靶向二代测序(tNGS)法。标本的采集、运输和保存严格按照公司的标准规范执行。采用广州美基生物科技有限公司的R6672-01B核酸提取或纯化试剂,广州市金圻睿生物科技有限责任公司tNGS试剂,广州市金圻睿生物科技有限责任公司KM MiniSeqDx-CN基因测序仪。操作过程：标本前处理→核酸提取→DNA/RNA建库→高通量测序。结果的判读：根据病原菌及其序列数,结合临床病情判定有无感染。

1.3观察指标 (1)记录传统病原微生物检测结果、NGS检测结果;(2)比较NGS检测与传统病原学检测检出率;(3)比较NGS检测与传统病原学检测的一致性;(4)以临床综合判断结果为“金标准”(采用肺泡灌洗液、血液、痰液等综合评估),分析NGS结果与传统病原微生物检测结果与临床诊断的符合率。

2 结 果

2.1传统病原微生物检测结果 经传统病原微生物检测,116例患儿中共检出阳性94例(81.03%),其中细菌感染4例(3.45%)、病毒感染2例(1.72%)、肺炎支原体感染83例(71.55%)、肺炎衣原体感染5例(4.31%),包含混合感染9例(7.76%)。见表1。

表1 传统病原微生物检测结果(n=116)

2.2NGS检测结果 对肺泡灌洗液进行NGS检测显示,116例患儿中共检出阳性111例(95.69%),其中细菌感染62例(53.45%)、病毒感染58例(50.00%)、肺炎支原体感染99例(85.34%)、真菌感染5例(4.31%),包含混合感染63例(54.31%)。见表2。

表2 NGS检测结果分析(n=116)

2.3NGS检测与传统病原微生物检测的检出率比较 NGS对细菌、病毒与肺炎支原体的检出率高于传统病原微生物检测,差异有统计学意义(P<0.001);2种检测方法对真菌及其他病原体的检出率对比,差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 NGS检测与传统病原微生物检测的检出率比较[n(%)]

2.4NGS检测与传统病原微生物检测一致性比较 NGS检测与传统病原学检测一致性不佳(Kappa=-0.079,P=0.017)。见表4。

表4 NGS检测与传统病原微生物检测一致性比较

2.5NGS检测、传统病原微生物检测与临床诊断的符合情况 NGS与临床综合诊断符合率为95.69%(111/116),高于传统病原微生物检测的81.03%(94/116),差异有统计学意义(χ2=12.114,P<0.001)。

3 讨 论

CAP是肺间质与肺实质的感染性疾病,患儿可产生咳嗽、发热、呼吸困难等症状,病情严重时伴有呼吸衰竭,还可引起多器官功能衰竭,具有病情进展迅速、病死率高等特点[9]。CAP的病原体包括病毒、细菌、支原体、衣原体、真菌、寄生虫等,病原体直接感染导致儿童死亡的肺炎占62%[10-11]。故早期明确病原体对临床治疗方案的制订具有积极意义。传统病原微生物检测中微生物培养周期较长且阳性率低,而病原体特异性核酸序列PCR、抗原/抗体免疫学方法等仅针对已知病原,难以检测未知病原,临床应用存在一定局限性[12-13]。

NGS采用高通量测序技术,能直接提取标本总DNA,使细胞彻底裂解,即便细胞在颗粒上附着,也能获取良好的破碎效果,有助于减少DNA流失,使微生物结构更完整,且无须微生物培养,检测过程包含标本采集、核酸提取、文库制备和测序、数据处理与分析、检测结果、报告解读,整个过程仅需2～3 d,与传统检测方法相比,大大缩短了检测周期,提高病原微生物的检测能力[14-15]。本研究中,NGS检测的阳性率为95.69%,高于传统病原微生物检测的81.03%,与临床综合诊断符合率高于传统病原微生物检测,提示NGS检测能够提高CAP病原体阳性检出率。NGS检测利用基因组学的研究策略,研究标本包含所有微生物的遗传组成及其群落功能,检测病原体覆盖广泛,且无偏移,并能够以序列为基础,检测出新发病原体,还能深入提供病原体分型、毒力因子与耐药基因,指导临床治疗,并具有快速、病原体阳性检出率高等优点[16-17]。但所有患儿入院后均已给予经验性的抗菌药物治疗,可能影响了微生物的培养,导致常规肺泡灌洗液的阳性率较低。本研究中NGS共检测出10种细菌、17种病毒、2种真菌,而传统病原微生物检测方法仅检测出4种细菌、2种病毒,提示相较于常规微生物检测,NGS检测的覆盖度更大、更全面。NGS能够在大部分传统方法检测阴性的标本中诊断出潜在感染的病原体,但二者的一致性较差,本次研究显示NGS检测与传统病原学检测一致性检验,Kappa值为-0.079,目前NGS尚不可替代传统实验检测成为“金标准”。本研究中,NGS检出细菌62例、病毒58例、混合感染63例,而传统微生物检测仅检出细菌4例、病毒2例、混合感染9例,提示NGS总的检出率高于传统方法,尤其在诊断病毒感染和混合感染方面更显著。NGS与常规ELISA、PCR等方法相比,其最大的区别为“非靶向”,即对检测标本中所存在的病原微生物“一网打尽”,防止患儿长期过多、过广地使用抗菌药物,实现从“精准诊断”至“精准治疗”,使患儿病程缩短,提高救治成功率,改善患儿预后[18]。但NGS检测也存在一定的缺陷,如：(1)各检测机构的测序平台不一、数据库不同、标本处理的试剂耗材各异,病原微生物鉴定的覆盖度、测序深度及相对丰度不同;(2)结果的判读尚无统一标准,定植菌、致病菌的界定一般需由临床医师根按照患儿临床表现来判定;(3)诊断价格较高。故NGS尚不能完全代替传统的诊断方法,对于一些重症或难治性CAP患者经验性治疗效果不佳的,可作为一种补充手段来识别病原体。tNGS技术是结合NGS与PCR的优势,用超多重PCR正向富集目标病原体,检测灵敏度明显提升,同时可排除宿主核酸干扰,经测序和生物信息学分析可实现多种临床场景的核心病原体鉴定,如不同症候群、患者类型、感染脏器等。tNGS较mNGS极大提高了检测灵敏度,且可以同时兼顾DNA和RNA流程,检测时间明显缩短,具有可定制化、测序成本低、病原谱范围明确等优点。

综上所述,NGS在CAP病原体检测中的应用价值较高,能够提高病原体阳性检出率,指导临床调整治疗方案,以期更好地改善患儿预后。