不同方法处理核酸片段的对比研究*

黄小晔,彭 丽,梁剑琦,陈 伟

湖南省娄底市中心医院检验科,湖南娄底 417000

新型冠状病毒(以下简称新冠病毒)感染的症状不同于典型肺炎,且对常规抗病毒治疗无效。在我国最新版本诊疗方案中,新冠病毒核酸检测仍为诊断提供直接证据[1],现在最常用的是实时荧光定量反转录PCR法,它是一种灵敏度和特异度高且已在临床广泛使用的感染性病原体核酸检测技术[2-3]。尽管核酸检测技术有诸多优点,但由于其超高的灵敏度,一旦实验室出现极微量的核酸污染,很容易导致假阳性,从而影响检测的准确性。有数据显示,实验室假阳性的发生率达9%～57%[4]。假阳性的结果跟实验室污染有非常紧密的联系,而实验室污染主要出现在标本处理环节的抽提核酸、检测环节的扩增产物和阳性质控的泄露等,这些情况均会导致严重的实验室污染。目前主要通过严格的带负压分区的物理隔绝方法及实验室标准操作规程防止核酸污染[5-6],但是这种方法只能延缓污染不能清除已经发生的污染。如何能够避免实验室污染的产生及污染产生后如何快速地消除,对于基层实验室来说是十分重要而且紧急的任务。本研究选取3种常见处理方式(75%乙醇、紫外线、含氯消毒剂)分别对2种不同长度(120 bp和1 600 bp)的高水平(>1013copy/mL)核酸片段进行清除,以2种核酸片段的混合液作为阳性对照,利用实时荧光定量PCR和琼脂糖电泳及凝胶成像技术,比较不同处理方法对核酸的清除效果。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 ABI 7500荧光定量PCR仪和E-Gel Imager凝胶成像系统购自赛默飞世尔公司,电泳仪购自北京君意东方电泳设备有限公司,西班牙琼脂糖、荧光定量PCR试剂盒、标志物、引物探针购于大连宝生物有限公司。

1.2方法

1.2.175%乙醇清除核酸 将100 μL混有2种核酸片段的混合液与等体积75%乙醇混匀,处理时间分别为0.5、2.0、6.0 h,每隔半小时振荡混匀一次,取5 μL为模板进行实时荧光定量PCR验证降解效果,同时取5 μL模板采用凝胶电泳(1%琼脂糖)验证核酸片段的完整性。

1.2.2紫外线清除核酸 将100 μL混合液暴露在紫外线下(紫外强度≥90 μW/cm2),暴露时间分别为0.5、2.0、6.0 h,加入适量纯水使暴露后最终体积仍为100 μL,取5 μL为模板进行实时荧光定量PCR验证降解效果,同时取5 μL模板采用凝胶电泳(1%琼脂糖)验证核酸片段的完整性。

1.2.3含氯消毒剂清除核酸 将100 μL混合液分别与等体积有效氯水平(分别为500、1 000、2 500、5 000 mg/L)的84消毒液混匀,处理2 h,期间每隔半小时振荡混匀一次,采用凝胶电泳(1%琼脂糖)鉴定不同水平下84消毒液对核酸片段的影响。

选取有效氯水平2 500 mg/L的84消毒液,将100 μL混合液与其等体积混匀,分别处理15、30、60 min,采用凝胶电泳(1%琼脂糖)鉴定此水平下84消毒液处理不同时间对核酸片段的影响。

2 结 果

2.1不同方法处理核酸片段的效果 75%乙醇和紫外线处理6 h以后,对高水平核酸片段清除无效,有效氯终水平≥2 500 mg/L可以有效降解核酸片段。见表1。

表1 不同方法处理2种核酸片段的效果

2.275%乙醇对核酸片段的清除效果 75%乙醇处理0.5、2、6 h后,琼脂糖凝胶电泳显示核酸片段完整性相对于阳性对照无明显改变,实时荧光定量PCR的CT值(15.32±0.10)亦无明显差别。见图1。

注：M为100 bp～1 500 bp DNA 标志物;1为阳性对照;2为处理0.5 h的混合液;3为处理2.0 h的混合液;4为处理6.0 h的混合液。

2.3紫外线对核酸片段的清除效果 紫外线分别照射0.5、2.0、6.0 h后,琼脂糖凝胶电泳显示核酸片段完整性无明显变化,荧光定量PCR的CT值(14.75±0.06)无明显差别。见图2。

注：M为100 bp～1 500 bp DNA 标志物;1为阳性对照;2为照射0.5 h的混合液;3为照射2.0 h的混合液;4为照射6.0 h的混合液。

2.4含氯消毒剂对核酸片段的清除效果

2.4.1水平因素 有效氯终水平≥2 500 mg/L的含氯消毒剂能有效去除2种不同长度的核酸片段,而终水平≤1 000 mg/L时,对高水平核酸没有清除能力。见图3。

注：M为100 bp～1 500 bp DNA 标志物;1为阳性对照;2为5 000 mg/L含氯消毒剂的混合液;3为2 500 mg/L含氯消毒剂的混合液;4为1 000 mg/L含氯消毒剂的混合液;5为500 mg/L含氯消毒剂的混合液。

2.4.2时间因素 有效氯终水平为2 500 mg/L的含氯消毒剂在处理30 min及以上时,可有效降解高水平核酸片段。见图4。

注：M为100 bp～1 500 bp DNA 标志物;1为处理15 min的混合液;2为处理30 min的混合液;3为处理60 min的混合液。

3 讨 论

由于核酸检测的广泛、快速普及,大量基层实验室开展了核酸检测,伴随出现的最突出问题便是核酸污染导致的假阳性结果,因为PCR产物拷贝量一般为1013copy/mL,远高于试剂所提供的500 copy/mL的检测限,所以极微量的PCR产物污染,就可造成假阳性。严格的物理分区及逐级负压,能最大限度地减少污染的产生,但是无法彻底避免。而且大量基层实验室没有条件做到严格物理分区,负压实验室更加困难,因此,防止和清除核酸污染是基层实验室迫切需要考虑的问题。实验室检测完成后采用房间固定和(或)可移动紫外灯紫外照射2 h以上,用0.2%含氯消毒剂或75%乙醇对实验台面、地面、生物安全柜等消毒处理,若有渗漏污染则用0.55%含氯消毒剂处理[7]。

乙醇通过使蛋白质脱水、变性凝固达到灭活病毒的效果,它不会直接破坏DNA[8]。实验室常通过喷洒乙醇对气溶胶进行物理沉降再联合含氯消毒剂或核酸去除剂等清除核酸污染[9]。本研究结果证明75%乙醇独立使用时对清除核酸片段无明显效果。清除核酸污染主要是通过双链间的氢键断开变成单链结构和形成光化产物如嘧啶二聚体等,从而改变DNA的生物活性,使微生物自身不能复制而致死。郭灵安等[10]研究表明,低强度的紫外线60 μW/cm2对小片段核酸污染的消除效果并不理想,本研究结果显示普遍存在于各实验室的紫外灯(紫外强度≥90 μW/cm2)对清除核酸片段并无明显效果,该研究结果与上述文献结果相似。含氯消毒剂产生的次氯酸和新生态氧能氧化蛋白质并直接裂解核酸,它在分子诊断实验室的使用价值已经得到证实[11],但含氯消毒剂的具体适宜水平和作用时间并不明确。陈茂义等[12]发现500 mg/L的有效氯水平作用30 min不能破坏存在于完整新冠病毒内的核酸成分,但是1 000 mg/L及以上的有效氯水平作用30 min后可以破坏。安超等[13]研究发现2 000 mg/L的含氯消毒剂能有效去除单独存在的核酸片段,但并未说明具体作用时间。由于本研究采用的是高水平的核酸片段(>1013copy/mL),明显高于标本内病毒含量或单独的阳性质控品(105copy/mL),且因过高的有效氯水平会破坏PCR反应试剂成分如酶类,故采用琼脂糖凝胶电泳鉴定其效果,得出的最低可清除高水平核酸的含氯消毒剂水平是2 500 mg/L,且至少需要30 min才能完全清除。

综上所述,有效氯终水平≥2 500 mg/L的含氯消毒剂处理至少30 min后能有效清除不同长度的高水平核酸片段,但是75%乙醇和紫外线处理6 h后对高水平核酸片段的清除效果不明显。84消毒液是一种廉价并广泛使用的含氯消毒剂,它在灭活病毒和清除核酸污染方面都具备非常明显的效果,在基层实验室大力推广的同时必须要关注它的使用水平和时间,以达到预期效果。