安徽省石台县日本血吸虫rDNA-ITS2和mtDNA-COX1遗传多态性研究

宇芙蓉 方佩斐 施 维 金 郁

当前，湖沼地区和山丘地区为我国血吸虫病的防治重点地区。安徽位于长江中下游地区，是我国血吸虫病流行最严重的湖区五省之一，流行区主要分布在皖江两岸，皖南山区和高邮湖畔[1]。自然界中生物的遗传变异普遍存在，DNA水平上的分子遗传学技术成为研究生物分类，判断物种基因型别的重要方法。其中日本血吸虫的核糖体DNA第二内转录间隔区（rDNA-ITS2）序列因为其进化速度快，种间变异明显大于种内变异，被作为有效的分子标记广泛用于种内变异的判断依据，而日本血吸虫的线粒体DNA（mtDNA）作为一种核外遗传物质，同样也是寄生虫群体遗传研究中一种较好的遗传标志，它进化速度快、群体内变异大，严格的母系遗传，具有高度均一性，非常有利于进行群体遗传分析。基于nadl、cox1和ITS2的PCR-RFLP技术是研究日本血吸虫的种群遗传结构、遗传多样性的一种有用的遗传标记，简便、快速，成本低[2]。本研究采用限制性片段长度多态性分析（PCRRFLP）技术，对安徽省山丘型流行区（石台）和南京地区日本血吸虫的核糖体DNA第二内转录间隔区（rDNA-ITS2）基因和线粒体DNA（mtDNA）细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mtDNA-COX1）基因进行种群遗传多态性分析，阐明安徽省山丘型流行区与其他地区日本血吸虫基因型差异，分析不同基因型日本血吸虫造成宿主损伤的差异，以有助于分析日本血吸虫种群遗传结构、群体遗传多样性及亲缘关系，深入了解日本血吸虫传播特征，为今后控制日本血吸虫病的流行提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 30只6~8周雌性野生型C57BL/6小鼠，体质量18~20 g，购自安徽医科大学实验动物中心，SPF级实验室饲养（24 ℃，55%湿度）[3]。

1.1.2 钉螺收集 ①实验组：以安徽省池州市石台杜村为试点，现场采集钉螺，在实验室用常规法筛选出感染性钉螺。②对照组：从南京市疾病预防控制中心购买阳性钉螺[4]。

1.1.3 主要实验仪器与试剂 ATC201型DNA扩增仪、DK-8D 型电热恒温水槽、JD-801凝胶成像分析系统、Power Pacl000电泳仪，离心机、PCR引物由上海通用生物有限公司合成，DNA提取试剂，ALT转氨酶检测试剂。

1.2 方法

1.2.1 感染方法 将从安徽石台地区采集到的钉螺带回实验室，逸蚴筛选阳性钉螺并继续饲养，2周后对钉螺再次进行逸蚴，收集石台组尾蚴；将从南京市疾病预防控制中心购买阳性钉螺放置在25 ℃光照下逸出尾蚴，收集南京组尾蚴。逸出的尾蚴采用腹部贴片法（15 min）感染C57BL/6小鼠，每只小鼠感染（20±2）只尾蚴，其中石台组尾蚴感染15只小鼠，南京组尾蚴感染15只小鼠。两组小鼠常规饲养至尾蚴感染35天后，门静脉灌注法分离和收集成虫。单只成虫收集于1.5 mL离心管（内有95%乙醇），-80 ℃超低温冰箱保存。

1.2.2 成虫DNA提取 将收集到的日本血吸虫成虫，0.01 mol/L PBS洗涤3次，用DNA提取试剂盒提取血吸虫成虫基因组DNA，在-20 ℃低温保存；同时，对感染小鼠眼球采血，置于1.5 mL EP管中，37 ℃放置30 min，4 ℃，6000 rpm离心10 min，按50 μL/支分装，-80 ℃保存；无菌收集小鼠肝脏样本用于后续实验。

1.2.3 血吸虫DNA片段扩增 PCR参照文献中[5-6]的分型标志物基因特异性引物ITS2和COX 1，以收集的实验组和对照组的血吸虫基因组DNA为模板，扩增2个基因片段。反应体系如下：血吸 虫DNA模 板1.5 L，ITS2上 游 引 物F：5-GCA TCG ATGAAGAACGCAGC-3和 下 游 引 物R：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3各1 L，COX1上游引物F：5-TCTTTRGATCATAAGCG-3和下游引物R：5-TAA TGCATMGGA AAAAAA CA-3各1 L，PCR Premix Taq 25 L，总体积为50 μL。94 ℃预变性5 min，94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35个循环，最后72 ℃延伸10 min。

1.2.4 RFLP-PCR基因分型 将两种血吸虫的PCR产物分别用Taq I限制性内切酶进行酶切消化。RFLP反应包括2 L限制性内切酶特异性缓冲液、1 L DNase、1 L无酶水、1 L牛血清白蛋白、1 L限制性内切酶和15 L PCR产物。为了防止反应混合物在反应管内蒸发，在每个反应管上加一层矿物油。然后在限制性内切酶特定温度（Taq I为65 ℃）下孵育4 h，之后加入1 L的限制性内切酶，反应孵育过夜以确保完全消化。然后将整个消化反应混合物装入2%的琼脂糖凝胶中，并在80 mV下进行一个半小时的电泳后观察时间结果。

1.2.5 病理学分析（小鼠肝脏石蜡切片HE染色） 将两组小鼠的肝脏样本进行组织脱水、石蜡包埋、制成5 μm切片后，脱蜡至水。HE染色：苏木素染色10 min，将肝脏样本胞核变蓝为止，自来水流水冲洗1 min；1%盐酸酒精分化30 s；自来水流水冲洗15 min以上；1%伊红酒精染5 min；自来水冲洗片刻；95%酒精30 s；无水酒精1 min，二甲苯5 min，烘干，中性树脂封片[7]。

1.2.6 谷丙转氨酶（ALT）检测 将小鼠眼球血离心后进行分离，收集血清，分别检测石台组和南京组小鼠血清中ALT水平，ALT检测试剂购自南京建成生物工程研究所有限公司，96T微板法，测定时设定标准品孔、样品检测孔，空白对照孔，操作过程严格按照试剂说明书进行。

1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，利用两侧不配对的Student's t-test进行统计学分析，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.4 伦理批准 所有动物实验均符合安徽医科大学实验动物管理委员会和伦理学委员会的相关规定（伦理批准号Syxk-2017-006）。

2 结 果

2.1 ITS2和COX1基因PCR结果 参照文献中的分型标志物基因ITS2和COX 1设计特异性引物，对两个地区的血吸虫成虫的基因组DNA进行扩增。两组ITS2基因均在500 bp有条带显示，两组COX1基因均在1400 bp有条带显示，如图1A和B。

图1 日本血吸虫ITS2和COX1基因RFLP-PCR基因分型结果

2.2 RFLP-PCR基因分型结果 将上述PCR产物进行Taq I限制性内切酶进行酶切后，检测到清晰的条带模式，可以区分石台组和南京组（见图1）。ITS2经Taq I酶切后，石台组和南京组的酶切图谱结果相同，在约250 bp，150 bp，100 bp处有3条带。然而，COX1经Taq 1酶切后，图谱结果不相同，石台组在1000 bp处有一条明显的条带，而南京组此处无条带。见图1所示。

2.3 石台组和南京组小鼠的肝脏肉芽肿大小以及血清ALT比较 HE染色结果，两组小鼠的肝脏表面布满大量大小不一，质地较硬的颗粒。镜下见大量的血吸虫虫卵肉芽肿，周围有大量炎性细胞浸润。但不同地区的两组血吸虫在小鼠肝脏单个肉芽肿的大小无明显差异（石台组：4.022×104μm2，南 京 组：3.972×104μm2，P＞0.05），见 图2。此外，两组的血清ALT同样也无明显差异（石台组：102.496 IU/L，南京组：99.29 IU/L，P＞0.05）。

图2 石台组和南京组小鼠肝脏肉芽肿及血清ALT表现

3 讨 论

安徽省石台县是典型的山丘型血吸虫病的流行区，刘效萍等[8]在2013年以安徽石台县杜村（山区）和以安徽省安庆市山口镇村（湖区）为调查点，开展人畜及野生动物病原学查病，发现安庆市山口镇村日本血吸虫病人的感染率为2.81%；牛的感染率为27.27%。牛排出的虫卵数占当地日排虫卵数的97.88%。石台县杜村感染血吸虫病人的感染率仅为1.25%，野鼠的感染率为12.24%。野鼠排出的虫卵数占当地日排虫卵数的99.67%，人仅占0.32%。另王素蓉[9]有实验证实自然光照周期下，山区感染性钉螺体内日本血吸虫尾蚴逸出高峰时段为下午17:00~21:00，表现为“晚逸蚴”，表明当地的阳性钉螺自然状况下多在夜间逸出尾蚴，这也与教科书上钉螺在一定温度、要有光照、白天逸蚴的生物学行为相悖。

采用PCR-RFLP对安徽省石台县日本血吸虫种群遗传多态性进行分析，通过与其他地区日本血吸虫的基因比较，可阐明当地日本血吸虫与其他地区日本血吸虫的基因型差异，最终鉴别何种原因造成日本血吸虫宿主易感性变异。在真核生物中，核糖体DNA转录区间即rDNA-ITS（ITS1和ITS2）系列由于进化速度快，种间变异明显大于种内变异，已经证明可用于种内变异的判断依据。此外，线粒体DNA序列（mtDNA）结构简单稳定，可以作为有效的遗传分子标记[10]，用于种群分类或示踪相关个体特殊种群的基因发展历史，广泛用于寄生虫的种类鉴定。

本实验研究安徽石台县日本血吸虫的核糖体DNA第二内转录间隔区（rDNA-ITS2）基因和线粒体细胞色素C氧化酶亚基（mtDNA-COX1）基因的遗传变异，结果显示，成功扩增出石台县和南京日本血吸虫的rDNA-ITS2片段，大小相同，均为500 bp左右，经Taq I酶切后，ITS2经Taq I酶切后，石台组和南京组的酶切图谱结果相同，在约250 bp、150 bp、100 bp处有3条带；也成功扩增出石台组和南京组的日本血吸虫COX1片段，大小均为1400 bp左右，然而，COX1经Taq I酶切后，结果却不相同，石台组在1000 bp处有一条明显的条带，而南京组此处无条带，由此判断石台组与南京组血吸虫在COX1基因片段上存在差异。石台县属于山丘型流行区，目前有大量感染血吸虫的阳性钉螺存在，但是人类的感染率却很低。从虫种的基因角度而言，石台组与南京组的日本血吸虫基因组存在遗传变异。本研究结果也显示，两种虫体感染小鼠后，小鼠的肝脏纤维化病理结果与转氨酶测定结果相似，说明石台组和南京组的日本血吸虫致病性并无差异。这一遗传差异的原因是否与人类对血吸虫的易感性有关尚有待进一步研究。

日本血吸虫病是一种对人体危害较大的寄生虫病，本课题利用PCR-RFLP技术对虫体rDNAITS2和COX1进行基因分型，结果发现两地日本血吸虫的线粒体基因COX1序列存在着差异，这将有助于我们深入了解当地血吸虫的传播特征，为后期研究日本血吸虫的种群遗传、多样性分析结构提供新数据，同时也为血吸虫病的防治提供新思路。