氮气诱导土沉香结香及挥发性成分分析

刘高峰　周再知　黄桂华　赵威威　张青青　宋晓琛

关键词：土沉香；氮气；人工诱导；挥发性成分

中图分类号：Q949.761.1；R284.1 文献标识码：A

沉香，通常指瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria Lam.）树种所含树脂的木材，是传统名贵药材和珍稀香料[1]，在医药、香料、化妆品等领域广泛使用。土沉香[Aquilaria sinensis（Lour.） Spreng.]是我国特有的珍贵药源树种[2]，是国产沉香主要植物来源。近年来，由于土沉香自然结香率低[3]，而沉香市场需求持续增长，探求安全、有效、稳量的人工诱导结香技术，及研究其结香机理成为国内外研究的热点[4]。

目前，人工诱导结香的方法主要有三大类，即物理法、化学法和生物法，其中前2 种是生产经营中常用的诱导方法[5]。物理法主要是在土沉香树干和枝条上制造创面，例如烧凿钻孔、斧头砍伤、机械打钉等[6-7]。化学法则是利用无机盐[8-9]、激素[10]等化學试剂液体输入的方式诱导树体结香。而生物法常采用组织接种或菌液输入的方式，通过不同种类真菌侵染而促进结香[11-12]。研究表明，采用化学法、生物法等单一处理时结香效果欠佳，因此液体输入法诱导结香时，常通过几种试剂组合处理方法来提高结香质量[9， 13]。研究发现，沉香挥发性成分香气浓烈且组成复杂，多采用气相色谱-质谱联用技术进行成分分析研究[14]，然而不同结香方法处理下沉香挥发性成分存在明显差异。采用新型诱导方式，如树干填充气体诱导土沉香结香及其挥发性成分分析均尚无报道。

早期研究表明，一些气态物质如CO₂、乙烯等在心材的形成过程中发挥着重要的作用[15]。NILSSON 等[16]研究显示，树干填充氮气能诱导樟子松（Pinus sylvestris）形成不同于边材的变色木材。刘小金[17]研究发现，N₂ 树干填充使檀香（Santalum album）形成的心材面积最大。鉴于以上研究，为了探明氮气诱导土沉香结香的效果，以10 年生土沉香为材料，采用树干填充高压氮气方式进行诱导，检测醇溶性物质含量及对挥发物成分进行分析，以期为人工诱导土沉香结香提供新技术及新理论。

1 材料与方法

1.1 材料

在广东省惠州市惠城区三栋镇土沉香人工种植基地内，选用生长健康、长势均匀的10 年生土沉香树[ 平均胸径（12.94±0.52）cm ， 平均树高（5.41±0.68）m]为研究材料，进行人工诱导结香处理。高压氮气纯度为99.90%。

1.2 方法

1.2.1 试验设计 采用随机区组试验设计，设置4 个处理，分别为树干打孔后每隔7 d 和15 d 填充1 次气体（分别以N₇和N₁₅表示），只打孔不充气（CK₁）和无任何处理（CK₂）。每个小区处理5 株，重复4 次，试验共计80 株。

1.2.2 树干填气方法 先将高压瓶中的氮气气体减压至0.1 MPa，再经橡胶管充入树孔内。用流量计计量注入气体的体积，每次以30 mL/min 速度充气50 s，共充入气体25 cm³。选择晴天进行树干充气，按试验设计方案，持续处理3 个月。

1.2.3 测定方法 （1）木芯变色范围测定。充气处理后10 个月时，沿树干纵向方向，分别在充气孔上、下方1 cm 处每隔2 cm 钻取木芯，黑色结香区以外，依次间隔3 cm 钻取木芯，直到木芯全为白木。在树干横截面方向上，分别在充气孔左右1 cm 处，每隔2 cm 钻取木芯，直到木芯全为白木。将木芯黑色区域称作沉香区，将含有部分黑色油线的浅褐色区域称作过渡区，分别测量纵向、横向变色长度。

（2）提取液制备。分别在处理结束后7 个月和10 个月时取样。取样时分别在N₇、N₁₅和CK1打孔上方5 cm 处截取5 cm 厚半圆片，除去白木部分，将木芯黑色不腐烂的区域称作沉香区，将含有部分黑色油线的浅褐色区域称作过渡区。分别将2 个区的样品置于40 ℃恒温干燥箱烘至恒重，粉碎后过40 目筛；对CK₂则是在树干40 cm处截取5 cm 厚半圆片，烘干粉粹过筛。

称取木粉2.00 g 置于离心管中，加入95%乙醇20 mL，在水浴中超声处理30 min，取上清液，加入乙醇，重复上述操作。汇总2 次上清液，过0.45 μm 滤膜，定容至50 mL。

（3）醇溶性提取物含量测定。参照2020 年版《中国药典》[18]，采用乙醇超声波浸提法测定。

（4）沉香四醇含量测定。采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱仪（Sciex 4000， SCIEX，USA; Sciex 4000 Qtrap， USA）测定。

色谱条件：色谱柱Kinetex C18（2.1 mm×100 mm， 2.6 μm）；流动相水，含0.1 %甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脱0～1 min，10% B；1～3.5 min，10%～70% B；3.5～4 min，70%～95% B；4～5.9 min，95% B；5.9～6 min，10% B；6～8 min，10% B。柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，进样量1 μL。

质谱条件： 离子化方式为电喷雾离子化（ESI），多反应监测离子扫描模式（MRM）测定。主要质谱参数为：脱溶剂温度为550 ℃，气帘气为25 μL/min，负离子模式下毛细管电压为5500 V，喷雾气为55 psi，辅助加热气为55 psi。

沉香四醇标准品购自GLPBIO 公司，纯度大于98%。将沉香四醇标准品用质谱95%乙醇不同梯度稀释后检测并绘制出标准曲线，然后取上述处理的沉香区提取液进行测定，并计算沉香四醇含量。

（5）挥发性成分测定。取处理后10 个月1.2.3（1）中沉香区的提取液，在华南农业大学测试中心进行GC-MS 检测分析（美国，安捷伦7890B-5977A）。

色谱条件：色谱柱HP-5MSZ（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：起始温度70 ℃，保持1 min后，以10 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；再以5 ℃/min 升至200 ℃，保持5 min；然后以8 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。进样口温度250 ℃；载气为高纯He（99.999%），载气流量1.0 mL/min，进样量0.2 μL（不分流），溶剂延迟4 min。

质谱条件：色谱-质谱接口温度280 ℃；离子源温度230 ℃；电离方式EI；电子能量70 eV，质量扫描范围35～350 amu。

1.3 数据处理

通过GCMS7890B-5977A 化学工作站积分器自动积分后，采用峰面积归一化法计算各化合物相对百分含量， 将所得化合物质谱数据通过NIST14 质谱数据库检索。采用Excel 软件进行数据处理，运用SPSS 19.0 和Origin 2021 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 结香范围

2.1.1 表观变化 7 d 处理1 次（N7）、15 d 处理1 次（N₁₅）和只打孔处理（CK₁）后，树干充气孔周围逐渐变色，并向四周扩散，颜色加深，而后变浅、直至白木。结香区和白木层之间存在明显界限。氮气处理下的变色范围明显大于CK₁，且N7 处理的变色面比N₁₅处理的更大。CK₁ 仅在打孔附近有变色发生，扩展狭小而缓慢。无任何处理（CK₂）健康的土沉香则无任何颜色变化。可见，不同处理的土沉香结香区域颜色和范围均不同（图1）。

2.1.2 纵向变色长度和横向变色宽度 氮气处理加速了土沉香木质部纵向、横向变色。从图2A可看出，处理后10 个月时，N7 和N15 处理的沉香区纵向变色长度差异不显著，但均显著高于CK₁。N₇处理的沉香区、纵向变色总长度均高于N₁₅ 和CK₁，分别达10.64、28.24 cm，分别是CK₁的4.38倍、3.35 倍。不同处理的纵向变色长度均高于横向变色宽度。横向变色宽度上（图2B），N₇处理的充气孔左、右1 cm 处均检测到黑色结香区，而N₁₅和CK₁处理均未发现。N₇处理的横向变色总宽度达3.52 cm，分别比N₁₅和CK₁提高18.53%和43.09%，由此可见高频次（7 d 处理1 次）填充氮气比低频次（15 d 处理1 次）处理诱导变色效果更好。

2.2 醇溶性提取物含量

树干填充氮气可显著提高土沉香的沉香区和过渡区中醇溶性提取物的含量。处理后7 个月时，N₇处理的沉香区和过渡区的醇溶性提取物含量均明显高于其他处理，其中沉香区的醇溶性提取物含量为17.87%，分别比N₁₅、CK₁提高14.04%和28.47%；過渡区的醇溶性提取物含量为9.73%，分别比N₁₅、CK₁提高38.21%和82.21%。此外N₁₅处理的沉香区和过渡区的醇溶性提取物含量分别比CK₁提高12.65%和31.84%（图3）。

从图3 可以看出，沉香区的醇溶性提取物含量随诱导时间的延长而逐渐增加，处理后10 个月时， N₇ 处理的沉香区醇溶性提取物含量达19.17%，比处理后7 个月的含量提高8.39%，且显著高于N₁₅、CK₁ 和CK₂处理；处理后10个月时，过渡区醇溶性物质含量均有所下降，其中N₇比处理后7 个月时含量下降20.86%，但仍明显高于CK₁，比CK₁高95.11%。

2.3 沉香四醇含量

如图4 所示，除空白对照（CK₂）未检测到沉香四醇外，树干填充氮气（N₇、N₁₅）和打孔对照（CK₁）均促进结香区沉香四醇的合成，且充气处理效果更好。处理后7 个月时N₇、N₁₅沉香四醇含量显著高于CK₁，分别是CK₁的2.23 倍、1.52倍。处理后10 个月时充气处理和CK₁结香区沉香四醇含量均高于处理后7 个月时的含量。N₇处理的沉香四醇含量最高，达0.30%，比N₁₅高42.86%，是CK₁的2.14 倍。N₁₅ 处理的沉香四醇含量也明显高于CK₁，比CK₁高51.49%，差异显著。CK₁处理后10 个月时的沉香四醇含量为0.14%，高于《中国药典》规定标准。

2.4 挥发性成分分析

处理后10 个月时，充气处理（N₇、N₁₅）和打孔对照（CK₁）结香区以及无任何处理（CK₂）样品的乙醇提取物总离子流图（TIC）见图5。由图5 可见，氮气处理的TIC 色谱图较为复杂，表明化合物种类较多。而CK₂的化合物种类最少。N₇处理的最大吸收峰为6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮（相似度96%），N₁₅处理的最大吸收峰为6-苄氧基-3，4-二氢-4，4-二甲基香豆素（相似度81%），CK₁ 则为2-（2-苯乙基）色酮（相似度97%），CK₂样品不含倍半萜和色酮类物质，但油酸酰胺（相似度94%）相对含量最高。

从处理后10 个月时的结香区样品中共鉴定出55 种化合物种类（表1）。这些化合物包括30种萜烯类化合物、6 种色酮类化合物、2 种甾醇化合物以及17 种芳香族、烷烃类、脂肪酸类等其他化合物。30 种萜类物质为7 种单萜、22 种倍半萜和1 种三萜类化合物。色酮类化合物中，主要有2 种类型。一种是5、6、7、8 位无取代基的色酮，主要为2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-（2-苯乙基）色酮；另外一种是5、6、7、8 位有取代基的色酮，主要为6-甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮、6，7-二甲氧基-（2-苯乙基）色酮、2，5-二甲基-7-羟基色酮、6，7-二甲氧基-2-[2-（4-甲氧基苯乙基）]色酮。

从N₇处理的结香区样品中检测到5 种单萜类（无环1 种、单环2 种、双环2 种）、19 种倍半萜类（单环4 种、双环7 种、三环8 种）和1 种三萜类物质。倍半萜类物质种类最丰富，包括没药烷萜类环氧化红没药烯、蛇麻烷类蛇麻烯、榄香烷类榄香烯等单环倍半萜，菖蒲烷萜类白菖烯、檀香烷萜类檀香烯、愈创烷萜类蓝桉醇、石竹烷萜类石竹烯等双环倍半萜，毕澄茄烷萜类香木兰烷、香树烯及其衍生物，花侧柏烷萜类柏木烯等三环倍半萜等。不同处理样品中的萜烯类化合物的相对含量差异较大（表1）。N₇ 处理的倍半萜和萜烯类种类和相对含量均明显高于N₁₅和CK₁，其中倍半萜类化合物的总相对含量占总萜烯类的84.48%，萜烯类相对含量达49.61%。N₁₅处理中，检测到16 种萜烯化合物，包括3 种单萜、12 种倍半萜和1 种三萜，其中倍半萜占总检测物质的11.87%。在N₇和N₁₅处理中均检测到角鲨烯（三萜类），但CK₁中未检测到。

各处理结香区样品中的色酮类物质种类和相对含量也存有明显差异。N₇处理中检测到5 种色酮类物质，5、6、7、8 位有取代基的色酮含量占总色酮含量的92.18%，其中6，7-二甲氧基-2-（2-苯乙基）色酮占总色酮的47.99%；而N₁₅处理中只检测到4 种色酮，其中5、6、7、8 位有取代基的色酮含量占总色酮的77.91%。CK₁处理中也检测到5 种色酮类化合物，其中5、6、7、8 位有取代基的色酮含量占总色酮相对含量的55.98%，但5、6、7、8 位无取代基的2-（2-苯乙基）色酮相对含量最高，占总色酮含量的38.18%。在CK₂样品中，主要成分以脂肪酸类为主，未检测到萜烯类和色酮类化合物。

3 讨论

3.1 氮气对沉香醇溶性物质和沉香四醇含量的影响

不同诱导方法所产沉香的挥发性成分不同，质量也不同且不稳定[19]。林峰等[20]比较了打钉法、砍伤法、凿洞法3 种物理方法以及化学方法诱导土沉香的结香效果，发现3 种物理法处理2 a后的醇溶性物质含量分别为9.7%、18.0% 和29.0%。本研究中，每隔7 d 填充1 次氮气，处理后10 个月时沉香区醇溶性提取物含量为19.37%，高于2020 版《中国药典》的要求，也高于上述2种物理方法，但低于化学诱导方法，这可能与检测时间较短有关。此外，氮气处理可以显著诱导土沉香中沉香四醇的合成，其含量远远高于《中国药典》的标准，进一步说明高压填充氮气可显著诱导土沉香次生代谢物质的合成，从而明显促进土沉香结香。

3.2 氮气对沉香挥发性成分的影响

通常认为，天然沉香中的倍半萜类成分种类较多、含量较高，而人工诱导的沉香则是2-（2-苯乙基）色酮类化合物的种类和含量较高[21]。不同诱导方法所产沉香往往因油脂含量、比重、颜色和气味的不同，其质量也有差异[22]。此外，也受诱导方式及结香年限等多种因素的影响[23]。YAN等[24]研究发现，斧伤诱导法所结沉香的倍半萜类化合物占主导地位，而生物和化学诱导法所结沉香中2-（2-苯乙基）色酮占60%以上。本研究中N₇处理后10 个月时所结沉香中，富含倍半萜、萜烯类和色酮类化合物。倍半萜类化合物总相对含量达41.93%，占总萜烯的84.52%。相比化学和生物诱导方法[25]，氮气处理诱导结香的质量更接近斧伤诱导方法，这可能是由于频繁填充氮气对土沉香木质部产生高压胁迫，一方面造成高强度的物理损伤，另一方面氮气参与生理代谢过程，从而激发萜烯类次生代谢物质的合成。有关树干填充高压氮气诱导土沉香的结香机理，待进一步深入研究。

本研究中，发现N₇和CK₁处理的样品中，尽管均检测到富含5 种色酮类化合物，但N₇处理的5、6、7、8 位有取代基的色酮相对含量高于CK₁，而CK₁中，仅5、6、7、8 位无取代基的2-（2-苯乙基）色酮相对含量最高。相比之下，氮气诱导下，所产色酮类物质的结构更复杂。由于NIST 和WILEY 质谱库中化合物的质谱数据有限，尤其是色酮类物质，可能导致GC-MS 方法检测到的色酮類成分不全面[24]。目前利用紫外分光光度法[25]、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS）等方法均可进行沉香特征性成分的检测[26]，但不同方法之间检测出的物质也有差异。YANG 等[27]采用高效液相色谱-电喷雾电离质谱法对沉香中2-（2-苯乙基）色酮衍生物进行鉴定，通过质谱特征裂解区分四氢色酮、双环氧色酮、单环氧色酮和flidersia 类型色酮等4 类色酮。随着检测方法的提升，沉香中更多的物质成分会被检测出来。因此， 采用GC-MS 和HPLC-MS 双重方法鉴定沉香的主要化合物成分及相对含量，更有利于全面了解结香效果。