补阳还五汤联合电针疗法对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的研究

苏文硕 樊光亚 肖连根 庞哲栋 董黎强 魏浩 安忠诚

[摘要] 目的 探究补阳还五汤联合电针治疗对脊髓损伤大鼠运动功能恢复的影响。方法 采用随机数字表法，将40只SD大鼠分成假手术组（n=8）、模型组（n=8）、实验1组（n=8）、实验2组（n=8）和实验3组（n=8）。造模成功后，实验1组和实验3组予补阳还五汤灌胃，1次/d；实验2组和实验3组电针治疗，1次/d；假手术组和模型组大鼠给予与实验1组和3组等量的生理盐水灌胃治疗；干预后1d、7d、14d和28d，每组随机处死2只大鼠，作为4个亚组，采用大鼠脊髓损伤评分（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating scale，BBB scale）评估每个亚组大鼠运动功能；采用苏木精-伊红染色法观察大鼠脊髓损伤后的脊髓组织形态。结果 假手术组大鼠评分无明显变化，实验1组、实验2组、实验3组7d、14d、28d的BBB评分整体高于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 补阳还五汤联合电针疗法对脊髓损伤大鼠的运动功能恢复有促进作用。

[关键词] 脊髓损伤；补阳还五汤；电针；大鼠

[中图分类号] R683      [文献标识码] A      [DOI] 10.3969/j.issn.1673-9701.2023.02.014

[Abstract] Objective To explore the effect of Buyang Huanwu combined with electroacupuncture on motor function recovery in rats with spinal cord injury. Methods Forty SD rats were divided into sham-operated group （n=8）， model group （n=8）， test group 1 （n=8）， test group 2 （n=8） and test group 3 （n=8） using the random number table method. After successful modelling， the rats in test group 1 and test group 3 were treated by gavage with Buyang Huanwu decoction once a day， and the rats in test group 2 and test group 3 by electroacupuncture once a day. The rats in the sham-operated group and model group were treated by gavage with saline in the same amount as in test group 1 and test group 3. On the 1st， 7th， 14th， and 28th days after the intervention， 2 rats in each group were randomly sacrificed as subgroups， and the motor function of hindlimbs of each subgroup was evaluated by Basso， Beattie & Bresnahan locomotor rating （BBB） scale; hematoxylin-eosin staining was used to observe spinal cord tissue morphology after spinal cord injury in rats. Result There was no significant change in the scores of rats in the sham group. The BBB scale of test group 1，test group 2 and test group 3 were generally higher than those of the model group at the 7th， 14th， and 28th， and the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Buyang Huanwu decoction combined with electroacupuncture in the treatment of spinal cord injury rats can promote the recovery of hindlimb motor function after spinal cord injury in rats.

[Key words] Spinal cord injury; Buyang Huanwu decoction; Electroacupuncture; Rat

脊髓損伤（spinal cord injury，SCI）是当今世界最具破坏性的疾病之一。研究显示，在过去的30年里，SCI全球发病率增长迅速，全球每年有25万～50万人发生SCI[1]。此外，SCI后神经系统的损伤不易恢复，患者需要终身治疗且费用高昂，给患者及其家庭造成极大的经济负担[2]。研究证实中药补阳还五汤在治疗SCI方面疗效确切，脊髓硬膜外电刺激也被证实能够有效促进SCI后运动功能的恢复[3]。因此本研究拟探讨补阳还五汤结合电针治疗SCI大鼠的疗效以及对其运动功能恢复的影响。

1  材料与方法

1.1  实验材料

1.1.1  实验动物  选取清洁级SD大鼠40只，采用随机数字表法，分为假手术组（n=8）、模型组（n=8）、实验1组（n=8）、实验2组（n=8）、实验3组（n=8），其中每个组内又分为1d、7d、14d和28d共4个亚组，每个亚组2只。大鼠体质量约250～300g，雌雄不限，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供，实验动物合格证号：SYXK（浙）2021-0011。

1.1.2  药品与仪器  补阳还五汤方剂组成：黄芪120g，川芎8g，当归尾8g，红花3g，赤芍5g，地龙3g，桃仁3g（购自浙江中医药大学附属第二医院中药房，水煎至75ml制成相当于含生药2g/ml的水煎剂）；自制Allens打击器（1ml注射器和30g克氏针）石蜡包埋机（德国徕卡Arcadia H）；病理切片机（德国莱卡RM2255）；华佗牌电子针疗仪（SDZ-ⅡB型）；华佗牌针灸针（0.35mm×13mm）。

1.2  方法

1.2.1  造模方法  在浙江中医药大学动物实验研究中心适应性饲养1周后，对大鼠进行腹腔注射麻醉，头部、四肢固定于鼠板上，常规备皮、消毒，定位T9～T11棘突，做1个3.0～4.0cm的纵形切口，依次切开皮肤、皮下筋膜，血管钳钝性剥离棘突两侧肌肉及棘间韧带，暴露T9～T11棘突及椎板，小咬骨鉗咬除T10棘突及椎板，充分暴露T10段脊髓，将约1mm厚的塑料垫片放在硬脊膜表面，采用Allens自制打击器，打击冲量选择75g·cm，打击高度为2.5cm[4]，垂直打击脊髓表面，撞击后克氏针在脊髓表面停留5s，造模完毕。假手术组仅切除相同节段椎体的椎板，保持脊髓完整，模型组和各实验组切除相同节段椎体椎板后同时对脊髓进行打击。脊髓损伤造模成功的表现为打击瞬间大鼠身体回缩扑动，尾巴痉挛性摆动，脊髓打击表面水肿、淤血，硬脊膜保持完整。

1.2.3  术后护理  大鼠恒温饲养在浙江中医药大学动物实验研究中心，每天定时换水和饲料；造模后每只SD大鼠肌肉注射青霉素8×104单位，1次/d，连续3d；人工挤压膀胱辅助排尿，3次/d，直至大鼠恢复自主排尿功能。

1.2.4  干预方法  ①实验1组、实验3组：将制备的含生药2g/ml的补阳还五汤水煎剂，根据大鼠与人的体表面积换算，计算出大鼠的用药剂量为3.5g/kg，按照1.75ml/kg的剂量灌胃，1次/d，持续4周。②实验2组、实验3组：将大鼠俯卧位固定后，选取T9和T11棘突旁两对夹脊穴，采用规格为0.35mm× 13mm的针灸针，直刺两对夹脊穴，深度4～5mm，针尖触碰到椎板，电针仪连接同侧的两根针的尾端，设置刺激频率为100Hz，电流强度为1mA，以刺激部位肌肉轻微抽动且不发生剧烈挣扎为适宜，1次/d，每次持续30min，连续刺激4周。③假手术组和模型组：予1.75ml/kg的生理盐水灌胃，1次/d，持续4周。

1.2.5  标本采集  各组大鼠分别在造模后1d、7d、14d、28d的时间点，麻醉后以T10节段为中心取长约2～3cm的目标脊髓，清洗干净后置于4%多聚甲醛溶液中固定，待后续作苏木精-伊红（hematoxylin- eosin，HE）染色处理。

1.3  观察指标

1.3.1  大鼠脊髓损伤（Basso，Beattie & Bresnahan locomotor rating，BBB）评分  将大鼠后肢运动分为22个等级，0分为完全瘫痪，21分正常。造模前对每只大鼠进行BBB评分，造模后1d、7d、14d、28d对实验大鼠进行评分。评分者为两名熟悉BBB评分的非本课题组人员，观察时间5min，结果取平均值。

1.3.2  HE染色  各组大鼠分别在造模后第1天、7天、14天、28天的时间点，麻醉后以T10节段为中心取长约2～3cm的目标脊髓，经磷酸盐缓冲液漂洗3次后，4%多聚甲醛溶液固定，制成石蜡标本，常规切片制成约4m厚的切片，HE染色，在显微镜下观察脊髓组织横断面的形态。

1.4  统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件对数据进行处理分析，计量资料以均数±标准差（）表示，各组不同时间点BBB评分采用重复测量方差分析，其余计量资料采用单因素方差分析，两两比较时采用方差分析LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1  BBB评分比较

造模后不同干预方法下，各组大鼠1d、7d、14d、28d时间点BBB评分比较，假手术组大鼠评分无明显改变，差异无统计学意义（P>0.05），实验1组、实验2组、实验3组在术后7d、14d、28d的BBB评分整体高于模型组，且随着术后时间进展评分逐渐上升，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2  HE染色结果比较

HE染色结果显示，假手术组镜下脊髓组织结构清楚完整，神经元形态完整，胞核位于细胞中央，核仁明显，胞体及树突中可见大量尼氏体。模型组光镜下可见脊髓组织被破坏，损伤处有大量红细胞聚集，炎性细胞浸润，胶质瘢痕形成，有大量空泡出现，尼氏体数量减少。与模型组相比，实验组镜下脊髓组织结构较清晰，炎性细胞浸润与红细胞较模型组减少，神经元数量增加，形态各异，中尼氏体数量增多，见图1。

3  讨论

SCI会导致患者感觉、运动和自主神经功能障碍，严重者可出现四肢瘫痪，甚至死亡。当前SCI的治疗依然是世界难题，由于继发性损伤是造成功能障碍的重要原因，所以目前治疗SCI的策略主要是针对继发性损伤，促进神经元的再生，重建中断的传导通路，恢复损伤平面上下的传导功能[5]。但是中枢神经系统可塑性较差，神经元再生能力有限，脊髓损伤后的再生修复极其微弱，目前尚未发现有效的临床治疗措施可使损伤两端轴突重新建立突触联系，完全恢复SCI后丧失的神经功能，这也是治疗SCI的困难所在。当前SCI主要依靠手术治疗、药物治疗和康复训练，对缓解继发性脊髓损伤有一定效果，但长期疗效并不乐观。

补阳还五汤是中医经典方剂，由黄芪、赤芍、川芎、当归尾、地龙、桃仁、红花7味药组成，诸药合用，共奏补气活血通络之功。近年来诸多研究证实，补阳还五汤在治疗SCI方面疗效确切，其治疗SCI的机制可能有以下几个方面：①改善SCI后脊髓组织缺血状态和炎症反应[6-8]；②减少SCI后神经细胞死亡[9-12]；③改善SCI后轴突再生的微环境[13-16]；④抑制SCI后胶质瘢痕的形成[17-18]；⑤抑制SCI后脂质过氧化反应[19]。但SCI的具体治疗机制尚未研究透彻，有待进一步研究与发现。此外，随着中医药事业的蓬勃发展，许多中医方剂和单味中药被证实用于治疗脊髓损伤具有明显疗效[20-23]，为治疗脊髓损伤提供了新的研究思路和方法。脊髓硬膜外电刺激也被证实能够有效恢复SCI大鼠后肢的运动功能[3]，中医夹脊电针在治疗SCI方面也确有疗效，薛玉满等[24]通过对SCI大鼠使用夹脊电针干预，发现夹脊电针治疗能够有效恢复SCI大鼠的后肢运动功能，其机制可能是通过提高血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，促进血管内皮生成，改善损伤组织的微环境。此外，也有研究证实，夹脊电针治疗SCI，促进肢体功能恢复的机制可能与增加B淋巴细胞瘤-2蛋白的表达，下调Bax蛋白的表达有关[25]。

本研究结果显示，假手术组大鼠评分无明显变化，实验1组，实验2组，实验3组在7d、14d、28d的BBB评分整体高于模型组，且随着术后时间进展评分逐渐上升，差异有统计学意义，说明补阳还五汤和电针疗法均可促进SCI后大鼠运动功能的恢复，二者联合治疗的疗效优于任何单一方法治疗，但其具体治疗机制还需进一步研究与探索。近年来，有研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植可修复损伤轴突周围的髓鞘，促进轴突再生，并协助新血管的形成，促进功能的恢复[26]。王璐瑶等[27]发现，补阳还五汤和MSCs移植联合治疗SCI的效果远远高于MSCs移植和补阳还五汤单独治疗。随着生物工程和干细胞工程的不断进步，与医学的联系进一步加深，生物材料支架与MSCs联合移植被证实能够填补脊髓神经细胞液化坏死形成的空腔，抑制胶质瘢痕形成，改善轴突再生的微环境，从而促进轴突再生[28]。在基因层面，LncRNA是继微小RNA后研究的热点基因，有大量文献和研究表明LncRNA在SCI模型中有差异性表达，这为在分子机制通过干预lncRNA来治疗SCI提供了新的思路与可能，有望成为判断SCI预后与SCI的新治疗靶点。

综上所述，补阳还五汤与电针均对SCI大鼠有治疗作用，由于本研究条件有限，下一步研究将对于补阳还五汤与电针治疗SCI与Lnc RNA表达之间的关系进行更深入的研究，希望可以为SCI的临床治疗提供新的思路与方法。

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（收稿日期：2022–07–24）

（修回日期：2022–09–07）