五味子总木脂素超声波微波协同辅助提取工艺及其主要成分含量

张金朋 赵 硕 郭晓帆 陈玉凤 齐永秀 刘媛媛

山东第一医科大学（山东省医学科学院）药学院，山东 泰安 271016

2020年版《中国药典》记载，五味子的入药部位为果实，其主要分布在我国东北部，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效［1］。五味子果实含丰富的营养成分［2］，其应用范围从中药制剂行业延伸到了食品工业领域［3］，成为当代新型“药食同源”产品。市场上流通的五位子保健品主要有五味子胶囊（软胶囊）、五味子口服液、五味子含片（咀嚼片、泡腾片）、五味子果酒和茶等［4］，其原材料五味子可增强血和脑的抗氧化酶活性，减弱丙二醛的氧化作用，具有延缓衰老［5］和改善学习记忆的能力［6］，可促进胆汁酸的代谢，预防胆汁淤积导致的肝损伤，保肝护胆［7］，以及增强抑制性神经递质γ-氨基丁酸与5-羟色胺对中枢神经系统的作用，促进睡眠，改善睡眠质量［8］。除此之外，五味子对于多种癌症如胃癌［9］、直肠癌［10］、肝癌［11］等均有一定抑制作用，这主要取决于五位子中的主要活性成分木脂素［12］。然而，五位子产品中有效成分含量低是当下市场存在的问题之一［13］，探索五味子活性成分的提取技术至关重要。超声波协同微波提取的方式结合了超声波的空化作用［14］、微波作用于细胞使细胞破裂和作用于极性分子后的升温作用［15-16］，且微波的加热作用可以弥补超声波产热不足的缺陷［17］，可缩短提取时间，降低工业成本，提高提取效率。本研究通过超声波-微波协同提取法，以浸泡过的五味子滤渣为原料，通过单因素和正交试验方法，优化五味子总木脂素的提取工艺，并利用超高效液相色谱（ultrahigh performance liquid chromatography，UPLC）法对最优条件粗提物中7 个木脂素成分的含量进行测定，以期为五味子在食品药品行业的研究和开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

五味子（批号03820021）购于河北仁心药业有限公司；五味子甲素（批号D1911039，纯度 > 98%）、乙素（批号E1822053，纯度 > 98%）、丙素（批号D1608128，纯度 > 98%）、醇甲（批号D1827017，纯度 > 98%）、醇乙（批号F1508140，纯度 > 98%）、酯甲（批号A1403056，纯度 > 98%）、酯乙（批号C1132591，纯度 > 98%）均购于阿拉丁生化科技股份有限公司。

Nexera X2 型超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；超纯水系统（美国Merck 公司）；ES-E120AⅡ型十万分之一分析天平（天津德安特传感技术有限公司）；浓缩设备（郑州长城科工贸有限公司）；xinyi-1A 型微波萃取仪、JY92-IIN 型超声波细胞粉碎机（宁波新艺超声设备有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 五味子酯甲标准品的配制及标准曲线的绘制

精密称取五味子酯甲2.67 mg，用甲醇配制浓度为0.534 mg/mL 的标准溶液。精密量取10、20、40、60、80、100 µL 于试管中，挥干溶剂，依次添加0.5 mL 1%变色酸，3 mL浓H2SO4和1.5 mL蒸馏水，摇匀，沸水浴30 min。冷却到室温，570 nm 处测定吸光度3次，取平均值。分别以质量、吸光度为横纵坐标，拟合五味子酯甲的线性回归方程。

1.2.2 五味子滤渣的提取工艺

精密称取60 ℃烘干至恒重的五味子适量，粉碎，加15倍体积的蒸馏水，常温浸泡过夜，分装后置8 000 r/min 离心10 min，滤渣置于60 ℃烘箱干燥至恒重，称重，计算滤渣得率（滤渣得率 = 滤渣质量/五味子中药材的质量× 100%），备用。

1.2.3 五味子总木脂素提取工艺的单因素试验

1.2.3.1 料液比对五味子总木脂素得率的影响精密称取4.0 g五味子滤渣5份，分别加入5、10、20、40、60 倍体积的80%乙醇，在超声功率和微波功率均为300 W，60 ℃下提取40 min。提取液置3 000 r/min离心15 min，取上清液测定五味子总木脂素的质量，并计算其得率（五味子总木脂素得率 = 五味子总木脂素质量/五味子中药材的质量× 100%）。

1.2.3.2 提取时间对五味子总木脂素得率的影响 精密称取4.0 g 五味子滤渣5 份，加20 倍体积80%乙醇，在超声功率和微波功率均为300 W，60 ℃的条件下分别提取5、10、20、40、60 min，试验结束后，分别同法测定样品中五味子总木脂素的质量，并计算其得率。

1.2.3.3 微波功率对五味子总木脂素得率的影响 精密称取4.0 g 五味子滤渣5 份，加20 倍体积80%乙醇，设置超声功率300 W 和温度60 ℃，分别在微波功率为50、100、200、400、600 W提取40 min。试验结束后，分别同法测定样品中五味子总木脂素质量，并计算其得率。

1.2.3.4 超声波功率对五味子总木脂素得率的影响 精密称取4.0 g 五味子滤渣5 份，加20 倍体积80%乙醇，设置微波功率300 W 和温度60 ℃，分别在超声波功率为50、100、200、400、600 W 条件下提取40 min。试验结束后，分别同法测定样品中五味子总木脂素质量，并计算其得率。

1.2.4 五味子总木脂素提取工艺正交试验设计

在单因素试验基础上，如表1所示，按L9（34）设计正交试验，每组实验重复3次。

表1 正交试验因素水平表

1.2.5 最优提取条件下五味子总木脂素的含量测定

按照最优提取条件提取五味子滤渣，将提取液冻干后，得五味子总木脂素粗提物的冻干粉，精密称定冻干粉的重量并以变色酸-浓硫酸反应测其总木脂素质量。分别记录称取的五味子滤渣质量为M1，五味子木脂素粗提物粉末的质量为M2及五味子木脂素粗提物粉末中总木脂素的质量为M3。五味子木脂素粗提物的得率= M2/ M1× 100%；五味子木脂素粗提物中总木脂素成分的含量= M3/ M2× 100%。

1.2.6 基于UPLC 最佳提取工艺所得五味子总木脂素粗提物中7个成分的含量测定

1.2.6.1 色谱条件 色谱柱：Ultimate® UHPLC XB-C18（1.8 µm，2.1×100 mm）；柱温：40 ℃；检测波长：267 nm；流速：0.3 mL·min-1；进样体积：1 µL；梯度洗脱程序见表2。

表2 五味子总木脂素粗提物梯度洗脱程序

1.2.6.2 对照品溶液的制备 精密称取7 个五味子木脂素对照品各1 mg，分别配置成浓度为500 µg/mL 的储备液。经稀释后配制这7 个木脂素成分的一系列浓度混合对照溶液，最终使五味子醇甲浓度为：2.5、10、20、40、60、80、100 µg/mL；其余6个物质浓度均为：0.25、1、2、4、6、8、10 µg/mL。经0.22 µm微孔滤膜过滤后保存备用。

1.2.6.3 供试品溶液的制备 精密称取最优提取条件下所得的冻干粉6.00 mg，以甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶，经0.22 µm 微孔滤膜过滤后进行定量分析。

1.3 统计学分析

采用统计软件SPSS 26.0 对计算结果进行分析，采用LSD 和SNK 方法进行方差分析，检验水准α= 0.05。

2 结 果

2.1 五味子酯甲标准曲线

在五味子酯甲质量为0 ～ 0.053 4 mg 的范围内，其与吸光度具有良好线性关系，回归方程为：y = 4.032 5 x + 0.300 9，R2= 0.995 5。

2.2 五味子滤渣得率

精密称取五味子粉末（过40目筛）500.00 g，加15 倍体积的蒸馏水浸泡过夜，除水溶性杂质后，8 000 r/min 离心15 min 得残渣沉淀，烘干后称其质量为225.10 g，计算滤渣得率为45.02%。

2.3 单因素实验结果

2.3.1 料液比对五味子总木脂素得率的影响 在其他条件保持不变时，料液比影响木脂素得率的结果见表3。料液比增大，得率升高，在20 mL/g 时到达峰值，随后得率因料液比的增大而降低。因此，本研究最终采用料液比为1∶20 的溶剂来提取五味子总木脂素。

表3 五味子总木脂素得率单因素实验结果

2.3.2 超声波功率对五味子总木脂素得率的影响 在其他条件保持不变时，超声波功率影响木脂素得率的结果见表3。随超声功率的增大，得率升高，200 W时达到最大，随后与超声波功率呈负相关。因此，选择150、200、300 W 3个水平进行正交试验。

2.3.3 微波功率对五味子总木脂素得率的影响在其他条件保持不变的情况下，微波功率影响木脂素得率的结果见表3。五味子总木脂素得率随微波功率升高而增大，在微波功率到达200 W后开始下降。因此，本研究使用微波功率为150、200、300 W 3个阶段设计正交试验。

2.3.4 提取时间对五味子总木脂素得率的影响当其他条件一定时，提取时间影响木脂素得率的结果见表3。0～20 min，得率随时间延长而升高，到达20 min以后，得率达到平衡，且有下降的趋势。提取时间为20 min 和40 min 时，得率相差甚小，因此，选择了20、30、40 min设计正交试验。

2.4 正交优化试验结果

鉴于对木脂素及仪器的保护，提取温度设定为60 ℃。最终规定料液比为1∶20，提取温度为60 ℃，以提取时间、微波功率和超声功率作为影响因素，设计L9（34）正交试验。

2.4.1 五味子总木脂素提取正交试验结果 以总木脂素得率为指标，在150、200、300 W 3 种超声功率下提取的五味子总木脂素，以200 W提取到的得率最高。提取时间从20 min 到40 min，木脂素得率在30 min 时最佳。微波功率在该正交试验中未能发现其功率大小与得率之间存在的关系，但微波功率为200 W时五味子总木脂素的得率均值较高，见表4。综合以上因素考虑，最优提取条件参数为A2B2C2，即超声和微波功率均为200 W、提取时间30 min。由极差可知，得率受3个因素影响的程度大小分别为：超声功率（A）>提取时间（B）>微波功率（C）。

表4 五味子总木脂素的得率L9（34）正交表及实验分析结果

2.4.2 五味子总木脂素提取正交试验结果方差分析 在本试验考察的影响五味子总木脂素得率的3个因素中，对得率影响较为显著的有超声波功率与提取时间（P< 0.05），微波功率的影响不明显（P>0.05），见表5。结合正交试验结果与方差分析结果确定A2为最佳超声功率，B2为最佳提取时间。在一定温度范围内，微波功率大小会直接影响温度升高的快慢，不会影响温度的高低，大功率的微波会影响仪器使用寿命，且微波功率对试验结果无显著影响，150 W和200 W微波功率的得率均值接近，所以为了维护仪器的寿命，选择C1为最优条件。综上，确定五味子总木脂素提取的最优提取条件为A2B2C1，即超声功率为200 W，提取时间为30 min，微波功率为150 W。

表5 五味子总木脂素得率正交试验结果方差分析

2.5 最优提取条件下五味子总木脂素的含量测定

精密称取3 份4.00 g 滤渣，按最优提取条件提取。如表6 所示，五味子木脂素粗提物中总木脂素的含量和得率均值分别为48.31%和8.55%。

表6 最优提取条件下五味子总木脂素的得率和含量

2.6 最优提取条件所得木脂素粗提物中7 个化学物质含量测定方法学考察及含量测定

2.6.1 系统适用性实验 按“1.6.2.1”项下色谱条件分析7个木脂素成分的对照品溶液和供试品溶液，考察结果见图1，五味子木脂素粗提物中7个化学成分的保留时间分别为3.76、4.51、8.31、8.57、12.24、13.13 和13.54 min，各色谱峰之间均能达到较好分离效果，且峰形对称。

图1 7个木脂素对照品及五味子木脂素粗提物供试品溶液UPLC色谱图

2.6.2 线性 取“1.2.6.2”项下配制的7个系列浓度的混合对照溶液，分别按照“1.2.6.1”项色谱条件进样1 µL，记录峰面积。以对照品浓度X（µg/mL）为横坐标，峰面积Y 为纵坐标，拟合线性回归方程。结果表明，五味子醇甲在2.5～100 µg/mL，五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素在0.25～10 µg/mL范围内具有良好的线性关系。见表7。

表7 五味子木脂素粗提物中7个化学物质含量测定方法学考察

2.6.3 加样回收率 精密称取6.00 mg 冻干粉共9份，均置于10 mL容量瓶中，平均分为3组。3组分别根据冻干粉所含7 个木脂素成分的含量加入0.5倍、1倍、1.5倍质量比的对照品溶液，定容至刻度后按照“1.2.6.1”项下色谱条件分析。由峰面积计算回收率及相对标准偏差（relative standard deviation，RSD），如表7 所示，表明该方法的加样回收率结果符合含量测定要求。

2.6.4 精密度试验 精密移取“1.2.6.2”项下配制的其中1份混合对照溶液，按照“1.2.6.1”项色谱条件连续进样6 次，计算峰面积的RSD 值，如表7。说明仪器的精密度良好。

2.6.5 稳定性试验 按照“1.2.6.3”项制备1份供试品溶液，分别在溶液配制后0、2、4、8、12、24 h 进样1次，计算峰面积的RSD值，见表7。表明待测物在24 h内稳定性良好。

2.6.6 重复性试验 精密称定6.00 mg 冻干粉6 份，按照“1.2.6.3”项平行制备6 份供试品溶液，分别于“1.2.6.1”项色谱条件进行分析，计算6份供试品溶液含量的RSD 值，见表7。表明该方法的重复性良好。

2.7 五味子总木脂素粗提物中7 个化学物质的含量测定

精密移取1 µL“1.2.6.3”项下配制的供试品溶液，按照“1.2.6.1”项色谱条件分析，并以标准曲线法计算供试品中7个木脂素成分的含量。经计算可知，五味子总木脂素粗提物中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素的含量分别为4.22%、1.04%、0.28%、0.88%、1.6%、1.71%和0.05%。

3 讨 论

本研究采用超声波微波协同辅助提取的方法，以单因素和正交试验优化了五味子总木脂素的提取工艺。与传统的加热回流法相比，本研究的优点在于引进了能产生较强剪切效应、空化效应的超声波和能够直接作用于分子的微波。超声波的作用使五味子总木脂素传质效率提高，得率升高［18-19］；而微波作用在分子上不仅可以使体系温度迅速升高，还能促进细胞的破裂，加快木脂素的溶解和扩散，所以溶出速度变快，溶出量增多［20］。除此之外，单因素实验证明了能够影响木脂素溶出率的因素还有料液比和提取时间，适当增加提取过程的料液比和提取时间可以减少过饱和与溶出不彻底等现象。但是当溶出速率达到平衡，提取时间将不再影响得率［21］，提取出来的木脂素长时间暴露在微波和超声波状态下，反而增加了结构降解和破坏的可能性［22］。料液比过大可能会导致作用在物料上的超声波与微波小于溶剂上的［23］，以及升温时间延长［24］等问题。同样的，高功率的微波存在明显的过热现象［25］，在较高加热速率下，细胞快速破裂，提取物的纯度可能降低，影响木脂素溶出速度和溶出量［22］；高强度的微波与超声波还会增加木脂素结构的破坏和降解，导致木脂素的得率下降［25-26］。因此，优化出五味子总木脂素的最优提取条件为：提取溶剂为80%的乙醇，料液比为1∶20，提取温度为60 ℃，微波功率为150 W，超声波功率为200 W，提取时间为30 min。五味子总木脂素的含量和得率分别高达48.31%和8.55%。在该提取条件下，通过UPLC法测得冻干粉中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素7 个化学成分含量分别为4.22%、1.04%、0.28%、0.88%、1.60 %、1.71%和0.05%。该方法准确性及重现性好，提取时间短，效率高，操作简便，可为后续五味子总木脂素功能性及其机制研究提供参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突