靶向CD73／PD-L1双特异性抗体的制备及其体外抗肿瘤功能评价

车耀健，胡妍，朱艳阳，胡莉

福建医科大学免疫治疗研究院，福建 福州 350108

癌症是世界范围内最重要的健康问题，预计至2040 年全球将新增2 840 万癌症病例，比2020 年增长47%［1］。肿瘤的免疫治疗是针对机体低下或亢进的免疫状态，人为地增强或抑制机体的免疫功能以达到治疗疾病目的的治疗方法，虽然也存在毒副作用，但相比传统治疗方法更加有效，副作用更小［2-3］。肿瘤微环境的改变是肿瘤发生发展必不可少的因素。在肿瘤发展过程中，肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）在体内对肿瘤细胞的清除是无效的，但去除肿瘤微环境中的免疫抑制时，该细胞又发挥了增殖和肿瘤杀伤的能力，因此，靶向肿瘤微环境中的分子或相关影响因子等改变肿瘤微环境的治疗方式，在治疗癌症过程中具有重要作用［4］。

程序性细胞死亡配体1（programmed cell deathligand 1，PD-L1）是B7家族中的一员，在体外可作为T细胞应答的抑制剂［5］，主要表达于肿瘤细胞表面，在正常人体组织和细胞中很少表达，仅扁桃体、胎盘及肺部和肝脏中小部分的巨噬细胞样细胞有表达［6］。作为程序性细胞死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）／PD-L1免疫检查点中重要的一个分子（肿瘤微环境中的免疫抑制分子），当肿瘤表面的PD-L1与T细胞表面PD-1结合后，会诱导T细胞的凋亡或T 细胞功能障碍［6］，并释放IL-10 等细胞抑制因子，引起免疫抑制作用，使肿瘤细胞逃避机体免疫系统的清除。目前已有多家制药企业研制出以PD 通路为靶点的治疗性单抗，PD-L1 抑制剂以罗氏公司的Tecentriq（atezolizumab）［7］为代表，取得了较好的临床疗效。

胞外5'-核苷酸酶（cluster of differentiation 73，CD73）是通过糖基磷脂酰肌醇（glycosy phospatidyl inositol，GPI）锚定在细胞膜上的多功能跨膜糖蛋白［8］。CD73 在一些肿瘤组织中高表达，包括膀胱癌、神经胶质瘤、白血病、成胶质细胞瘤、黑色素瘤、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌等［9］。在肿瘤生长、进展和转移过程中，肿瘤细胞通过多种途径来逃避免疫监视，其中一个机制依赖于腺苷信号［10］。CD73 催化单磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）水解为腺苷和磷酸盐，腺苷能通过多种通路在免疫系统中发挥作用［11］，如高浓度的腺苷能减弱自然杀伤（natural killer，NK）细胞生成肿瘤坏死因子α和γ干扰素的能力，并通过A2A 受体途径抑制NK 细胞的溶细胞杀伤作用；高浓度腺苷同时也会使巨噬细胞释放大量的免疫抑制因子，如IL-4和IL-10等［12-13］；腺苷也可分化树突状细胞释放大量的免疫抑制因子，如IL-8、IL-10、COX2等［14］。腺苷在肿瘤发生发展过程中具有重要作用，有研究表明，靶向腺苷的免疫治疗有助于增强T 细胞功能［15］。另外，阻断CD73／腺苷通路还可提高一些化疗药（多烯紫杉醇）对上皮性卵巢癌的治疗效果［16］，因此靶向CD73的研究越来越多。CD73单抗的研制为抗肿瘤治疗提供了新的途径，目前已有CD73单抗正在进行临床研究，如MEDI9447（AZ／Medimmune）和BMS-986179（BMS）等。

CD73抗体在临床上具有一定的治疗效果，CD73靶点可能成为未来肿瘤免疫治疗的潜在靶点，与免疫检查点相关分子联用可成为一种新的治疗方法［17-18］，但抗体联用也存在一定局限性，因此制备同时靶向CD73 及PD-L1 的双特异性抗体，以改善肿瘤微环境，解除对免疫细胞的双抑制，提高抗肿瘤的作用。目前构建双特异性抗体的模式有多种，如tandem diabody（tandAB）［19］、BiTE、DVD-Ig、Lock（DNL）、scFv-Ig、scFv2-FC、knob into hole［20］等。还有研究通过将单链抗体（single-chain fragment variable，scFv）插入至完整IgG1的铰链区中，制备多功能抗体，并且已有该类型抗体（MEDI3902，靶向绿脓杆菌的三型毒素分泌系统的抗体）进入临床试验［21-22］。本研究利用基因工程改造的方法制备抗CD73／PD-L1 双特异性抗体，避开了抗体联用潜在的缺陷。将制备的抗体经CHO细胞表达系统进行筛选并优化培养条件以获得高产细胞株，对纯化后的抗体进行纯度、体外结合能力、体外杀伤肿瘤细胞能力的检测，以验证抗体的成药性及抗肿瘤功能。

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞、基因及序列 质粒pC17、pC18以及CHO K1、MC38（PD-L1-，CD73-）、MC38（PD-L1+，CD73-）、MC38（PD-L1-，CD73+）细胞系由本院保存；人肺癌细胞系Calu 1 购自武汉普诺赛（Procell）生命科技有限公司；抗体重链和轻链基因序列（抗CD73 可变区序列来自人CD73单抗BMS-986179，PD-L1可变区序列来自阿替利珠单抗）以及PD-L1及CD73基因片段均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 血液样品 为本院志愿者提供。本研究获得福建医科大学生物医学研究伦理委员会批准，文件号：［2020］福医伦理审字第（8）号，志愿者身体状况均为健康。所有志愿者均知情同意。

1.3 主要试剂及仪器 限制性内切酶购自日本TaKaRa公司；T4 DNA 连接酶购自美国NEB 生物技术有限公司；质粒大量提取试剂盒购自德国Macherey-Nagel公司；三角细胞摇瓶、PBS、DMEM 和1640 培养基购自美国Corning 公司；山羊抗人IgG-Fc（PE）预吸附二抗购自英国Abcam 公司；CD-CHO 培养基、补料培养基Feed C+、Human T-Activator CD3／CD28 Dynabead 购自美国Gibco公司；EX-cell CHO cloning 培养基、蛋氨酸亚氨基代砜（MSX）、AMP（adenosine monophosphate）、白介素-2（interleukin-2，IL-2）购自德国Sigma 公司；Protein A层析柱（HiTrap mabselect SuRe 5 mL）、HiLoad superdex 200 26／600 购自美国Cytiva 公司；Acqutiy UPLC protein BEH Column 1.7 μm 分子筛分析柱购自美国Waters公司；AKTA蛋白纯化系统（型号：AKTA avant 25）购自美国Cytiva 公司；全自动细胞计数仪（型号：TC20）和凝胶成像系统（型号：Chemi-DocTM XDR+）购自美国Bio-Rad公司；生物分子相互作用分析仪（型号：octet red 96）购自美国Pall 公司；超高效液相色谱仪（UPLC，型号：Acquity H-class）购自美国Waters 公司；流式细胞仪（型号：FAC-SVerse）购自美国BD 公司；酶标仪（型号：SpectraMax I3）购自美国Molecular Devices 公司；电转仪（型号：4D-Nu-cleofector）购自瑞士Lonza公司。

1.4 抗体制备及细胞筛选 按图1A 所示，设计并合成基因序列，将合成的抗体重链基因连入质粒pC17中，轻链基因连入质粒pC18中，经限制性内切酶NotⅠ和PvuⅠ酶切2 个质粒，将带有重链和轻链的2 个基因片段经T4 DNA 连接酶连接至同一载体上；按图1B 所示，将anti PD-L1 scFv 插入至完整的anti CD73抗体铰链区中，构建抗CD73／PD-L1双特异性抗体，命名为BS-21（同时分别构建抗CD73 及PD-L1 抗体质粒作为对照抗体）。用试剂盒抽提质粒，经限制性内切酶（NotⅠ／PvuⅠ）进行酶切鉴定，鉴定正确后，经NotⅠ单酶切线性化，电转仪转染至CHO K1细胞，静置培养24 h（培养基中添加了L-谷氨酰胺）；用EXcell CHO cloning 培养基（加入终浓度为50 μmol／L的MSX，不添加L-谷氨酰胺）稀释细胞，加至96 孔板中，100个／孔，37 ℃培养过夜，扩增过程中用半量换液的方式进行换液；细胞扩增至长满孔板面积50%以上，取上清，用生物分子相互作用分析仪检测表达量后，选3孔细胞密度及表达量较高的细胞进行扩大培养，最终选出1 株表达量最高的细胞进行流加培养，培养基为CD-CHO；按0.3×106个／mL 接种至三角细胞摇瓶中，置摇床（120 r／min）37 ℃培养，通过优化培养条件提高表达量，包括加入Feed C+补料培养基的体积（总体积的5%或10%）、补料添加时间（隔天或每天加）、收获时间等，培养期间每天进行细胞计数、糖含量监测等，通过补加一定量的葡萄糖溶液（浓度100 g／L），控制培养基糖含量为3 ～5 g／L。用相同方法制备anti CD73和anti PD-L1抗体作为对照抗体。

图1 双特异性抗体构建示意图Fig.1 Schematic diagram of bispecific antibody construction

1.5 抗体纯化及分析 采用Protein A 亲和层析方法进行初纯：将Hitrap mabselect SuRe 5 mL 柱子用PBS平衡5 个柱体积，用20 mmol／L 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（pH 3.5）洗脱，收集洗脱液，用1／10 体积的1 mol／L Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）进行中和；初纯完成后，用超滤管浓缩，再经HiLoad superdex 200 26／600 分子筛进行精细纯化，流动相为PBS。采用分子排阻高效液相色谱（size exclusion chromatography-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）技术进行纯化抗体分析，色谱柱为Acqutiy UPLC protein BEH Column 1.7 μm分子筛分析柱，流动相为PBS，上样量为10 μL，流速为1 mL／min。

1.6 双特异性抗体体外结合能力检测 运用慢病毒载体技术将人PD-L1及CD73基因片段分别感染MC38（PD-L1-，CD73-）细胞，得到MC38（PD-L1+，CD73-）和MC38（PD-L1-，CD73+）细胞，再分别加入不同抗体进行流式细胞术检测，验证BS-21 抗体结合人CD73 与PD-L1 的能力。具体方法如下：收集细胞至流式管中，800 ×g离心3 min；弃上清，加入2 mL PBS 溶液重悬细胞，800×g离心3 min；弃上清，将管底细胞悬起，各管分别加入BS-21、抗CD73、抗PD-L1 抗体，4 ℃孵育20 min；加入2 mL PBS，800 ×g离心3 min；弃上清，加入山羊抗人IgG-Fc（PE）预吸附二抗，4 ℃孵育30 min；加入2 mL PBS，800×g离心3 min；弃上清，加入300 μL PBS，上流式细胞仪检测。

1.7 细胞刺激活化及扩增 取志愿者血液样品，分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），将细胞与磁珠（human T-activator CD3／CD28 dynabeads）按照1∶1 比例混合2 h；加入IL-2，37 ℃培养48 h；采用半量换液方法继续培养扩增。

1.8 双特异性抗体体外杀伤能力检测 采用体外杀伤试验。用刺激活化好的PBMC 杀伤人肺癌细胞系Calu 1，24 h后计算活细胞比例。首先采用流式细胞术鉴定Calu 1 细胞，然后进行体外杀伤试验：将Calu 1细胞铺至48孔细胞培养板中，2 000个／孔，37 ℃过夜培养；吸弃培养基，每孔加入200 μL活化后的PBMC（培养基中加入终浓度50 μmol／L 的AMP），同时进行3个效靶比（效应细胞∶肿瘤细胞）的试验，其中每孔T细胞数量分别为2×105（效靶比为10∶1）、4×105（效靶比为20∶1）和1×106（效靶比为50∶1），分别加入终浓度为10 μg／mL 的抗体（anti CD73、anti PD-L1、BS-21），对照组仅加对应抗体不加效应细胞，同时anti PD-L1 组设不加AMP 的对照组（AMP-组），37 ℃培养24 h；弃培养基，PBS洗涤1次，加入5%福尔马林固定细胞15 min，100 μL／孔；PBS 洗涤2 次，加入0.05%结晶紫蓝色10 min，100 μL／孔；清水缓慢冲洗至无色，室温晾干，过夜；加入1%SDS溶液室温放置30 min，100 μL／孔；酶标仪检测570 nm波长处A值。A值越高，活细胞密度越高。按下式计算细胞杀伤率。

1.9 统计学分析 采用GraphPad Prism 5 软件进行统计学分析，组间比较采用单因素方差分析（One Way ANOVA），以P＜0.05 为差异有统计学意义。流式数据分析采用FlowJo软件。

2 结果

2.1 细胞筛选及其纯化抗体的鉴定 对筛选到的细胞株进行扩大培养，细胞生长曲线见图2，第6 天细胞生长达到平台期，第13 天细胞活率和细胞密度开始下降。为获得更高表达量，最终确定优化后的培养条件为：第3、5、6、7、11、13天添加10%体积的Feed C+补料培养基，每天监测糖含量，补加葡萄糖控制糖含量为3 ～5 g／L，第14天收获细胞。

图2 细胞生长曲线Fig.2 Curves of cell growth

收获上清约400 mL，经分子相互作用分析仪测定细胞上清表达量为0.402 g／L，经Protein A及分子筛纯化最终获得150 mg抗体。纯化抗体的SEC-HPLC分析结果显示，BS-21相对分子质量高于单抗，因此最先出峰，保留时间更靠前，纯度可达99.6%。见图3。

图3 BS-21（A）、anti PD-L1（B）、anti CD73（C）SEC-HPLC分析图谱Fig.3 SEC-HPLC profile of BS-21（A），anti PD-L1（B）and anti CD73（C）

2.2 体外结合能力分析 BS-21和anti PD-L1可结合MC38（PD-L1+，CD73-）细胞，而anti CD73不结合；BS-21 和anti CD73 可结合MC38（PD-L1-，CD73+）细胞，而anti PD-L1 不结合；3 个抗体均不结合MC38（PDL1-，CD73-）细胞。见图4。表明BS-21 能够同时结合PD-L1 和CD73 分子，并且具有较好特异性，无非特异性结合。

图4 抗体结合能力Fig.4 Binding ability of antibodies

2.3 体外杀伤能力 Calu 1 表面同时表达PD-L1 和CD73分子，同时BS-21也能够结合Calu 1细胞，见图5。进行的3 个效靶比试验中，效靶比为50∶1 时，杀伤效果最好。在培养基中补加高浓度AMP 时，BS-21组杀伤率显著高于anti CD73和anti PD-L1组（F均为30.36，P均＜0.001），表明CD73 能够水解培养基中高浓度的AMP 为腺苷，BS-21 抑制了CD73 水解酶活性，降低了腺苷浓度，同时也阻断了PD-L1／PD1 通路，因此BS-21 同时降低了2 个靶点的抑制作用，杀伤率增强；而培养基中不加AMP 的anti PD-L1（AMP-组）杀伤率显著强于添加了AMP的anti PD-L1组（F=30.36，P＜0.001），表明在培养基中去除高浓度AMP后，解除了腺苷抑制，加上anti PD-L1 本身即可阻断PD-L1／PD1通路，因此杀伤率增强。见图6。

图5 Calu 1细胞鉴定结果Fig.5 Identification results of Calu 1 cells

图6 抗体介导的肿瘤细胞杀伤率比较Fig.6 Comparison of antibody-mediated killing rate of tumor cells

3 讨论

通过抗CD73 来改变肿瘤微环境可与免疫检查点抑制剂或传统的肿瘤治疗产生协同作用。抗CTLA-4 单抗和抗PD1 单抗等药物已表现出较好效果，在小鼠模型中，抗CD73单抗显著增强了抗CTLA-4和抗PD1 单抗的抗癌活性［23］。PD-1／PD-L1 单抗、放化疗等治疗方案可能引起肿瘤微环境CD73 表达升高，继而通过腺苷信号抑制免疫反应，使治疗效果减弱，即获得性耐药。CD73 阻断治疗与其他免疫分子调节剂联合（如PD-L1 抗体）是有前景的治疗选择，靶向CD73的治疗策略具有作为单药或联合疗法应用于临床的潜力。目前抗CD73 抗体（MEDI9447）单用或联合抗PD-L1 抗体用于晚期实体瘤患者治疗的研究已处于临床研究阶段（Clini-calTrials.gov Identifier：NCT02503774）［24］。2018 年美国癌症研究协会（American Association for Cancer Research，AACR）年度会议上，研究人员公布了BMS-986-179的Ⅰ期临床初步结果，数据显示，截至2017年12月19日，共59名患者接受BMS-986179 单药或与Nivolumab 联用的治疗，7名患者获得部分缓解（partial response，PR），另10名患者病情稳定（stable disease，SD），联合疗法的安全性与Nivolumab单药一致［25］。因此，构建抗CD73／PD-L1双特异性抗体也具有广阔的应用前景。

在构建的一些双特异性抗体中，虽然有杀伤肿瘤细胞的功能，但这些抗体不是表达量过低就是组分太复杂，聚体含量太多，不利于下游纯化，成药性可能不大。而BS-21 是应用GS 表达系统，将双特异性抗体转入CHO 细胞中，经MSX 加压筛选，筛选出表达量相对较高的混合稳转细胞株，进行流加培养后，最终表达量为0.4 g／L。纯化过程中发现，BS-21经Protein A 一步纯化后，聚体比例不高，纯度可达90%以上，更利于下游纯化，从另一方面说明，该重组双特异性抗体能够进行大规模生产。而目前该细胞是混合细胞株，接下来为提高表达量，使其接近工业级生产标准，可进行单克隆筛选，筛选出表达量更高的单克隆细胞株，并对培养基及补料等培养条件进行优化，以提高抗体产量。目前来看，BS-21 具有较好的成药性可能，但尚需对其进行更加全面的成药性评估，如抗体稳定性，亲和力分析等。

BS-21 同时具有抗CD73 及PD-L1 抗体的作用，在肿瘤微环境中能解除腺苷对效应细胞的抑制作用，同时能够阻断PD1／PD-L1 通路，更好地改善肿瘤免疫微环境，从而提高抗肿瘤的能力。双特异性抗体的优势是2 个靶点抗体在同一分子上，只要抗体能顺利到达肿瘤微环境中，即可同时发挥2 个靶点抗体的作用，而抗体联用有可能出现2 个抗体不能同时作用于同一个肿瘤细胞或效应细胞，导致虽然解除了一个方面的免疫抑制，但另一个免疫抑制依然存在，无法同时起作用，抗肿瘤效果就会下降。体外杀伤试验证明，在两种抑制作用均存在时，BS-21 组的杀伤率提高，表明其可在一定程度上同时降低CD73 和PD-L1 的免疫抑制，而anti PD-L1 没有提高杀伤率；但去除培养基中AMP 后，杀伤率提高，因此，在仅解除一种抑制的情况下，杀伤率不会提高。体外试验证明BS-21具有很好的抗肿瘤作用，接下来需在动物模型中进行体内评价，验证其在体内的抗肿瘤作用是否优于2个单抗联用。

人类体内的免疫系统极其复杂，除了CD73 外，肿瘤还可通过其他机制或信号通路出现免疫抑制或免疫逃逸，鉴于此，联合多个靶点的抗肿瘤药物可能是未来肿瘤治疗的策略。BS-21 是将scFv 插入至完整的抗体中制备的双特异性抗体，该抗体主要功能是解除免疫抑制作用，因此基于该模型的优势，可通过改造FC 片段，如knob into hole 模式，在不改变抗体整体结构框架的条件下，引入一些增强T 细胞活性的靶点抗体（如抗CD3 抗体、41-BB 抗体等提供一些刺激信号），同时也可促使免疫细胞进入肿瘤微环境中，该改造未改变BS-21 整体大构象，对其成药性影响不大，制备的三功能或四功能抗体既能缓解肿瘤微环境中的免疫抑制，又能在一定程度上刺激免疫细胞，增强杀伤功能，以进一步提高抗肿瘤作用。

综上所述，靶向CD73 与PD-L1 的双特异性抗体BS-21从成药性和抗肿瘤的功能来看，均具有较好的前景。经CHO 表达系统表达的BS-21，抗体组分单一，仅有少量聚体，易于下游纯化，同时表达量也高，具有较好的成药性。BS-21 能够同时降低PD-L1 和CD73 对免疫细胞的免疫抑制功能，与单药相比具有更好的抗肿瘤效果。另外抗体生产成本较高，价格也较高，而BS-21 具有双特异性抗体的独特优势，与抗体联用的治疗方法相比，能在一定程度上减少抗体用量，降低治疗成本。BS-21可能成为一个潜在的生物大分子药物，为未来抗肿瘤的免疫治疗提供了更多可行性。